RNAi对大肠癌SW620细胞survivin基因的影响

目的：探讨RNAi(RNA interference)对survivin在大肠癌细胞SW620表达的影响及siRNA干扰后诱导肿瘤survivin表达降低的机制。方法：构建survivin特异性的RNA封闭性载体survivinl通过培养大肠癌细胞SW620,survivin封闭性载体转染SW620细胞;Hoechest染色大肠癌细胞,通过荧光显微镜观察细胞形态学情况;流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡情况。结果：DNA测序证实表达质粒构建成功,转

维普资讯 http://doc.guandang.net

天津医药 2 0 0 7年 9月第 3 5卷第 9期

7

R N A i对大肠癌 S W6 2 0细胞 s u r v i v i n基因的影响孙海东摘要

常爱华

董

鹏

朱理玮

目的：探讨 R N A i ( R N A i n t e f r e r e n c e )对s u r v i v i n在大肠癌细胞 S W6 2 0表达的影响及 s i R N A干扰后诱导

肿瘤 s u r v i v i n表达降低的机制。方法：构建 s u r v i v i n特异性的 R N A封闭性载体 s u r v i v i n l通过培养大肠癌细胞 S W6 2 0, s u r v i v i n封闭性载体转染 S W6 2 0细胞； H o e c h e s t染色大肠癌细胞，通过荧光显微镜观察细胞形态学情况；流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡情况。结果： D N A测序证实表达质粒构建成功，转染后的大肠癌细胞核明显可见凋亡

小体；流式细胞仪分析大肠癌细胞系 S W6 2 0的凋亡率 s u r v i v i n l为1 0 . 0 3%。结论： R N A i能够下调 s u r v i v i n,并促进大肠癌细胞系 S W6 2 0的细胞凋亡。

关键词

R N A干扰

结直肠肿瘤

癌

细胞凋亡

肿瘤细胞，培养的基因表达

E f e c t s o f RNAi o n Su r v i v i n i n Co l o r e c t a I Car c i n o ma Ce l I L i n e SW 6 2 0S U N Ha i d o n g, C HANG Ai h u a, D ONG P e n g, Z HU L i we i

D e p a r t m e n t o fS u r g e r y, A￣ i a t e d Ho s p i t a l o fMe d i c l a c 0

o fC h i n e s e P e o p l e

Ar me dP o l i c e F o r c e s, T i a￣' m 3 0 016 2, Chi n a

A b s t r a c t Ob j e c t i v e:T o i n v e s i t g a t e t h e e f e c t s a n d me c h a n i s m o f R N A i n t e f r e en r c e o n s u r v i v i n e x p es r s i o n i nt r a n s f e c t e d c o l o ec r t l a S W6 2 0 c e i l s . Me t h o d s: RNA i n t e fe r

en r c e p l s mi a d f o r s u r v i v i n g e n e wa s c o n s t r u c t e d nd a S W6 2 0 c e l i sw e r e t r a n s f e c t e d wi h t he t p l s mi a d . I mmu n o l f u o es r c e n c e ic m ms c￣y Wa s u s e d t o o b s e r v e he t c e l l u l a r mo r p h o l o g y f o l l o in w g h o e c h e s t s t a i n i n g .R e s u l t s:T h e s u c c e s s f u l c o n s t r u c i t o n f o p l s mi a d f o s u r v i v i n g e n e Wa s c o n f L r me d b y DNA s e q u e n c i n g .

Ap o p t o t i c b o d i e s w e e r o b s e ve r d i n he t n u c l e i f o t r a n s f e c t e d c e l i s . F C M na a l y s i s d e mo n s t r a t e d ha t t he t a p o p os t i s r a t e f o

t r a n s f e c t e d c e l l s i n d u c e d b y s u vi r v i n Wa s 1 0 . 0 3%. Con c l u s i o n:RNA i n t e r f e en r c e C n a d o wn - eg r u l a t e s u vi r v i n g nd a i n d u c et u mo r c e l i a p o p os t i s i n c o l o ec r t l a c a r c i n o ma S W6 2 0 c e l l s .

K e y wor d s RNA i n t e fe r r e n c e c o l o r e c t a l n e o p l a s ms c a r c i n o ma a p o p t o s i s t u mo r c e l l s . c u l t u r e dg en e e xp es r s i o n

大肠癌传统治疗方法是以手术治疗为主，同时辅以化疗和放疗，而化疗和放疗对肿瘤非特异性，敏感性差，且不良反应大，效果常不令人满意。近些年来随着人们对肿瘤发生、发展和转移认

识的加深， 提出了一个新的概念——基因治疗，肿瘤基因治疗需要有效的目的基因和强有力的技术手段，而 s u卜

公司产品，琼脂糖和 E B为 S i g ma公司； l i p o f e c t a mi n e

v t r o—

g e n公司);细胞：大肠癌细胞系 S W6 2 0 (武警医学院生化教研室陈立军教授馈赠),菌种为大肠杆菌 D H S a菌种 (晶赛生物工程技术有限公司，武汉 );质粒为 p G e s i l一 1 (晶赛生物工程技术有限公司，武汉 )。

1 . 2主要仪器

倒置光显微镜 ( O L Y MP U S,日本 )。 Mi l i i— Q

纯水器 ( MIⅢ P o R E,美国), S A N Y O超低温冰箱 (日本 ),流式细胞仪 ( F A C S C l a i b u r B . D C o .美国), A n n e x i n V— F I T (:凋亡检测试剂盒(鼎国生物技术有限公司)。1 . 3实验方法

v i v i n ( 1 9 9 7年 )和 R N A i ( 1 9 9 8年 )被发现，为大肠癌的治疗提供了途径与方法。s u r v i v i n是凋亡抑制蛋白( i n h i b i t o r o f a p o p t o s i s p r o t e i n s, I A P )家族中的一

员。I A P家族是继 B c l一 2家族后发现的又一类凋亡

1 3. . 1 s h R N A结构 D N A序列的构建

( 1 )根据 G e n B a n k中

调控蛋白， s u r v i v i n广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，但仅在少数正常成人组织表达【 n。因为它表达于几乎所有的人类肿瘤，这就为肿瘤靶向治疗提供了一个良好的应用前景。1材料与方法1 . 1材料 R P MI 1 6 4 0培养基为 G I B C O公司产品。 Ho e c h . e s t 3 3 3 4 2为 S i g ma公司产品。新生小牛血清为德国 C h e mi c l a

报道的 s u r v i v i n的核苷酸序列，参考 s i R N A的设计策略，分别设计二对 s h R N A序列。构建一个载体编码一条 s h R N A的质粒表达载体。s u vi r v i n D N A引物： s u vi r v i n l的目的基因为 G G A C C A C C G C A I℃ I℃ I AC I A,两条链分别为。 s u r v i v i n l一

1: 5 一 匪 A C C A C C G C A I℃ I℃ T A- C A T r C A AG A C G T G T A G A G

A T C, C G G T C . G T C C T T I’ I’ I ' I’ G A A T T— c] - 3 , s u r v i v i n l一 2。 3 一I C T G G T G G c G T A G A G A T G T A A— G T Y C T G C A C A T C T C T A C G作者单位： 3 0 0 1 6 2武警医学院附属医院外科 (孙海东，常爱华，董鹏 );天津医科大学总医院普通外科 (朱理玮 )