通过AFM观察内皮细胞不同阶段纳米结构的变化及异常黑胆质成熟剂

通过AFM观察内皮细胞不同阶段纳米结构的变化及异常黑胆质成熟剂疗法对“退行性”硬化性主动面瓣膜病的影响

发表时间：2016-12-09T13:29:08.897Z 来源：《中华急诊医学杂志》2016年6月作者：作者：第一作者：艾斯卡尔·沙比提，第二：艾力·艾比不拉，第三

[导读] 随之时间的延长，高脂饮食组主动脉内皮细胞受到明显破坏而异常黑胆质成熟剂对内皮细胞起到保护作用。

新疆医科大学第一附属医院心脏外一科（830054）

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目，编号：2014211C060。

3、作者简介：艾斯卡尔·沙比提（1973—），男，新疆人，硕士，心脏外一科主任医师，副教授，硕士生导师。

通讯作者：哈木拉提·吾甫尔，新疆医科大学校长，博士后，博士生导师，主任医师，教授。

摘要：目的异常黑胆质成熟疗法能否影响“退行性”硬化性主动脉瓣膜病的发展。方法健康新西兰纯种雄性白兔100只,适应性喂养1周后,实验开始前处理20只，剩余80只随机分为4组，即正常对照组(N组)、高脂饮食组(HC组)、阿托伐他汀干预组(AI组)、异常黑胆质成熟剂干预组（MI组）。于0和8周末两点采血行血脂分析。在0,2,4,6,8周时间段，取出主动脉瓣膜标本，AFM下观察内皮细胞纳米结构。结果 HC组与N组相比，TG，TC，LDL，HDL测量结果均有明显差异，（P＜0.01）。MI组HC组相比，TG，TC，LDL，HDL的测量结果均有显著差异（P＜0.05）。AFM50um×50um扫描下HC组与MI组内皮细胞长径6周、8周均有明显差异（P＜0.01）。与HC组相比，MI组内皮细胞长径有明显差异（P＜0.01）。AFM500nm×500nm扫描下HC组内皮细胞表面隆起直径8周有明显差异（P＜0.01），高度6周，8周有明显差异（P＜0.01）。与HC组相比，MI组内皮细胞表面隆起直径8周有明显差异（P＜0.01），高度8周有差异（P＜0.05）。结论随之时间的延长，高脂饮食组主动脉内皮细胞受到明显破坏而异常黑胆质成熟剂对内皮细胞起到保护作用。

关键词：退行性钙化性主动脉瓣膜病(DCAVD)；异常黑胆质成熟剂；原子力显微镜（AFM）；

主动脉瓣膜钙化可引起主动脉瓣狭窄、关闭不全等疾病，导致老年退行性瓣膜病的重要病理改变。西方国家整体人群中发病率达2.5%，严重危害患者生命安全，造成沉重的社会负担。由于除手术外缺乏有效的治疗手段，因此该探讨主动脉瓣瓣膜钙化的机制，研究阻断其病理过程进展的可能性已经成为近年来心脏外科医师关注的热点之一[1]。

AFM以其能够以高分辨率和简单制样方法观察生物样品的表面精细结构的特征,而在生物医学领域的应用逐渐广泛[2-4]。AFM是通过检测样品表面和针尖相互作用力的变化来获得样品表面信息的,便可获得样品表面起伏的结构图像[5]。

根据维吾尔医学体液论大量研究结果及研究发现异常黑胆质成熟剂具有抗氧化、抗钙盐沉积、抗炎、免疫调节、抗血小板聚集、改善血液流变学和抗血栓形成的功效[6]。故本研究组认为同过异常黑胆质的调整血粘度，抗钙盐沉积，抗炎，抗氧化等作用，利用AFM证实，成熟剂疗法能否影响“退行性”硬化性主动脉瓣膜病的发展，从而达到延缓疾病的发展。

材料与方法

1、药品与试剂阿托伐他汀（辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408，产品批号L27840）。异常黑胆质成熟剂异常黑胆质成熟剂是由破布木果、牛舌草、铁线蕨、刺糖、蜜蜂花、熏衣草、地锦草等药物组成[7]。根据异常黑胆质的成熟剂和清除剂及其制备方法及质控标准严格按照专利号C082130082．8。

高脂饮食按文献报道方法，家兔86.5%标准饲料配方中添加1%胆固醇，7.5%蛋黄粉，5%猪油，按动物体重5%给予。

Anti-CD68单克隆抗体、CD3单克隆抗体、CD31单克隆抗体、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)单克隆抗体等由新疆乌鲁木齐欧易生物医学科技有限公司提供。

2、技术服务与主要仪器血脂分析由新疆医科大学第一附属于医院检验科提供。原子力显微镜上海复旦大学纳米研究所提供，型号：Bruker Dimension Icon。

3、动物来源由新疆维吾尔自治区医学实验动物中心提供，并经自治区医学实验动物中心委员会认证和批准。

4、分组及给药健康新西兰纯种雄性白兔100只,体重1.8一2.4千克,适应性喂养1周后,实验开始前处理20只，剩余80只随机分为4组，即正常对照组(N组):20只,喂饲普通颗粒兔饲料;高脂饮食组(HC组):20只,予高脂饮食喂养;高脂饮食加阿托伐他汀干预组(AI组):20只,高脂饮食喂养同时予阿托伐他汀(4mg/kg.d)灌胃；高脂饮食加异常黑胆质成熟剂组（MI组）：20只，高脂饮食喂养同时予异常黑胆质成熟剂

5.069/kg(5.0g成熟剂溶于1ml蒸馏水中,生药量17.16g/kg) 灌胃；药物用蒸馏水配成溶液后以灌胃方式,每日给药一次。所有动物均自由饮水。并分别于实验开始及第2、4、6、8周末5个时间点,各测兔体重一次,以观察其生长情况并调整饲料及药物剂量。

5、实验方法 1）0周与8周采动物血清行血脂分析。2）分别在0,2,4，6,8周取出主动脉瓣膜，按照原子力显微镜生物标本制备方法制作标本，分别在50μm×50μm和500nm×500nm扫描范围下观察主动脉瓣膜[8]。

6、观察指标 1)采用酶法用全自动生化分析仪检测血浆中胆固醇(TG)，甘油三脂(TC)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)浓度。2）分别在AFM50μm×50μm和500nm×500nm扫描范围下，观察及测量主动脉内皮细胞长径，短径，高度，细胞表面隆起直径及高度。

6、统计方法利用SPSS统计软件(19.0版本),各组数据以均数±标准差（）表示,组间比较采用单因素方差分析，当P<0.05时,差异具有显著性的统计学意义。

结果

生长发育情况

各组兔体重随实验进展都有所增加,但各组之间无明显差别,各组兔生长发育情况基本相同,说明饲高脂饮食和阿托伐他汀干预及异常黑胆质成熟剂干预对兔生长发育未明显影响。

血脂各项指标的变化

N组血脂在实验前后无明显变化,HC组血脂水平8周末时,较实验前均明显升高;同期AI组与MI组各项血脂水平均明显低于HC组(p<0.05)