分子生物学诊断技术的应用(三)

主要针对动物的分子生物诊断

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畜牧

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分子生物学诊断技术的应用( )三杨峻(北省农科院畜牧兽医研究所/物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，北武汉湖动湖中图分类号：8 443￥ 5 . 文献标识码： B

406 ) 30 4

文章编号：0 7 2 3 2 1 1 - 0 4 0 1 0— 7 X( 0 0) 1 0 0— 3

5免疫印迹技术免疫印迹又称 Wet n bo.与 D A的 S uh s r lt e N o t— e印迹技术相对应 .种技术均把电泳分离的组分 m两从凝胶转移到一种固相载体 (常为 N通 C膜 )然后，用探针检测特异性组分。不同的是， s r lt Wet n bo所 e检测的是抗原类蛋白质成分 .用的探针是抗体 .所它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应该技术结合了凝胶电泳分辨率高和固

凝胶加样缓冲液中裂解制备好的样品用做 S S D— P G A E分析。 蛋白质的 S S P G D— A E分析 P E过程有三种 AG

物理效应可使样品分离开来，包括样品的浓缩效应、 凝胶的分子筛效应、般电泳的电荷效应。因此，一样品分离效果好 .分辨率高而 S S P G D— A E是将强阴离子去污剂十二烷基硫酸钠 (D )还原剂巯基乙 s s与醇并有 .通过加热 .并使蛋白质解离成多肽后再加样于电泳凝胶上由于各种 S S多肽复合物均带负 D一

相免疫测定特异敏感等诸多优点 .具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测 .以从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记目前 . een bo广泛应 Wst lt r用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究5.基本方法 1

电，形状近似，且因此 .复合在电场中的迁移率只该取决于蛋白质的大小 .样通过 S S P G这 D— A E可将不同大小的蛋白质样品分离开来 .借助已知分子量的标准参照物 .可推算出相应的分子量 51将蛋白质从凝胶转移到 N .. 2 C膜上操作方法如下： 6块精细滤纸。块 N剪一 C膜 (小应与

凝胶大致 )并在转移缓冲液 (8 o/ r— 1, 4 mm lL T i HC . s 3 m lL甘氨酸，.3%S S中浸泡 3 5 i;转 9 mo/ 00 7 D )~ mn将一

先将待检测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中 .过 S S聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( A E)经 D P G分离各组分 .后通过印迹技术把分离样品几乎原位、然

移电泳槽塑料支架平放，依次置放海绵、滤纸、 3块 NC膜、胶及另外 3块滤纸和海绵，置过程注意凝放驱除夹层间气泡用支架夹紧上述各层 .电转移槽置

定量转移到 N C膜上随后进行类似间接 E IA法 LS测抗原的反应 .即用特异抗体与 N C膜上的靶抗原磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白进行反应 .最后通过与

中， C膜一侧靠正极，胶一侧靠负极；通电源， N凝接 反应 .结合上的抗体可用与辣根过氧化物酶或碱性 4 V、 1 A转移 1~ .h转移时间长短依靶蛋白 0约 . 6 . 6O ( 6

分子量大小来调节 )转移结束，出 N:取 C膜做好上、

酶的底物发生显色反应来做检测实际操作时 .把印迹后的 N常 C膜分成两部分 .一

下端标记。下一小条做蛋白质染色处理 .切以检查转移效果； NC膜置于干净滤纸上。温自然干燥。将室51 ..封闭这一步处理的目的在于封闭 N 3 C膜上一

部分如上所述做免疫检测。另一部分直接进行蛋

白质染色 .以便对转移情况做直接观察和判断待测

些非特异性蛋白质的潜在结合位点 .以避免非特

抗原所处位置及推算其分子量。操作方法具体如下： 511样品的制备样品制备方法的选择取决于样 ..品的类型和待测抗原的性质细菌样品一般直接用

异性反应。通常是在 P S缓冲液中加入 1 B%的脱脂奶粉或牛血清蛋白配成封闭液 .并将 NC膜浸泡其中.室温封闭 1 h左右

S S凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物组织通常可机 51 D .-免疫检测和显色反应包括 N 4 C膜与第一抗

械分散并直接溶于 S S凝胶加样缓冲液组织培养 D的单层细胞可用去污剂温和裂解 .也可直接在 S S D

体、酶标二抗 (即第二抗体 )应，反以及用酶相应

的底物处理进行显色反应将封闭好的 N C膜浸入第一

收稿日期：0 0 0— 0 2 1— 9 3

基金项目：代农业产业技术体系建设专项资金资助 (y y一 2 G— 4)动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室项目(0 0 D18现 nct 4一 3 0; x 2 1Z 0 )作者简介：杨峻 (9 3,,北江夏人，究员， 15一)男湖研主要从事禽病预防研究，电话 )2— 7 8 1 3电子信箱 ) na gO 3 6 . l。 ( 07 8309 ( j yn2 1@13C l u Ol

主要针对动物的分子生物诊断

第 1期 1

【家讲座】专

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抗体溶液中，体液以 02/ m调节用量 .温或抗 . mL c 2室 3 q温和振荡反应 l 2;弃去抗体液，B 7C~h P S洗涤；将 N C膜浸入酶标第二抗体反应液 .用量与一抗相同 . 3 c或室温振荡 l 2:弃二抗反应液，B 7C~h P S洗涤；将膜放入相应显色液中 .察显色反应阳性反应将在 观

15 9 2年 L r ui a等及 1 5 9 3年 B r n等研究噬菌 et i a体时发现了宿主控制性现象 . re及其同事用放射 Abr同位素标记证明 .菌体在新品系中伴随有 D A的噬 N降解 .宿主自己的 DN但 A并不降解 .据此他们提出了限制一饰酶假说 对于一个宿主细胞 .制性酶修限

靶蛋白相对应的位置上出现有颜色的条带 .而其余位置无显色条带出现

及 D A甲基化酶是其细胞中的一对酶 .它们对 ND A底物有相同的识别顺序 .但有相反的生物功 N

52免疫印迹技术应用 -用免疫印迹技术可定性、定量地检测出待检样品中含量很低的特定病原体的抗原成分于一些能感染细胞而细胞病变不易观察的病原体的检测也很有用用单克隆抗体作为第一抗体进行免疫印迹 .还可以对病毒做分型研究

能.限制性酶的功能是在 D A分子内部水解 . N甲基化酶是修饰 . N分子经修饰后 .就可逃避限制性 DA酶的识别 .而甲基化酶只修饰宿主自身的 D A. N从而避免了限制性酶对自身 D A的破坏 N611限制性酶分型主要分为三种类型 I限 .. 型

制酶为复合功能酶 .具有限制一修饰两种功能 .在但

D A链上没有固定的切割位点 . N一般在离切割位点 lb到几 k k h的地方随机切割 .不产生特异性片段

19 9 0年 .班牙等一些发现有非洲猪瘟的国家西已将 E IA结合 Wet n bo技术广泛应用于非洲 LS s r lt e猪瘟病毒 ( S V)体的检测以帮助实施 A F AF抗 S V扑灭计划先用 E IA技术对大批血清样品进行初 LS

Ⅲ型酶与 I型酶基本相似 .不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点 .这两类酶对 D A酶切分析的意义但 N不大通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够

筛 .随后用 Wetr bo技术对阳性样品进一步做 s n l e t

验证 .可有效排除假阳性反应。 9 5年 . jaa 19 A c rzC等应用基因工程技术成功建立了特异性更为理想的重组 Wetr l技术他们用大肠杆菌系统克隆并 s R bo e t表达了 A F S V抗原性病毒结构蛋白 p 4将重组 p 4 5. 5作为抗原建立了 Wet n bo检测技术原有的 s r l e t Wet bo技术所用的抗原是通过病毒感染哺乳 s m lt e动物细胞而分离获得 .可避免有细胞杂蛋白干扰不而应用重组蛋白作为抗原 .分专一 .成可保证检测结

识别与切割 D A链上的特定的核苷酸顺序 .生特 N产异的 D A片段。 N 612识别序列及消化产物的末端结构限制性酶 ..

的识别序列 .大部分具有双轴对称性结构或称回文序列纵轴一侧的序列以横轴为中心旋转达 10 .将 8￣则纵轴两侧的序列相互对称 .这种结构又称为双重

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