产大环糊精4_糖基转移酶的分离纯化及其性质研究

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第29卷第3期

2010年5月

食品与生物技术学报

Vol.29 No.3May 2010

文章编号:1673 1689(2010)03 0336 06

产大环糊精4 糖基转移酶的

分离纯化及其性质研究

冀雪霞, 王金鹏, 徐学明, 金征宇

无锡214122)

摘 要:4 糖基转移酶能够作用直链淀粉产生大环糊精。作者研究了重组E.coliDH 5 TA(保藏编号:3093)产生的4 糖基转移酶的分离纯化及酶学性质。粗酶液经过65 处理20min、Ni-NTA亲和层析、生物半透膜脱盐得到目标酶,该酶经SDS PAGE凝胶电泳呈单一蛋白条带,其相对分子质量为57000。该酶具有较高的转糖基活性且最小作用底物为麦芽糖。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度为75 ,最适pH值为7 5;该酶具有良好的耐热性,在70~85 酶活维持在80%以上;酶的pH稳定范围为6 0~8 5。关键词:4 糖基转移酶;大环糊精;分离纯化;酶学性质中图分类号:TS236.9

文献标识码:A

1,2

1,2

1,2

*1,2

(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡214122;2.江南大学食品学院,江苏

PurificationandPropertiesof4 Glucanotransferase

ProducingLarge RingCyclodextrin

JIXue xia1,2, WANGJin peng1,2, XUXue ming1,2, JINZheng yu*1,2

(1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;2.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)

Abstract:4 glucanotransferasehasthefunctionofgeneratinglarge ringcyclodextrin.ThecrudeenzymesproductionbythegeneticmutantofE.coliDH 5 TA(CGMCCNo.3093)wasseparatedandpurifiedbyhigh temperatureprocessing(65 ,20min),Ni NTAaffinitycolumnanddialysis.ThepurifiedenzymewasdemonstratedbySDS PAGEtobeahomogeneousproteinandthemolecularweightwasestimatedas57KDa.ItwasprovedtobewiththehighleveloftransglycosylationactivitybyHPLCwhichwasalwaysusedtomeasuretheoligosaccharideanditssmallestsubstratewasmaltose.Theenzymeexhibitedhighstabilityatthetemperaturerangefrom70 to85 andthepHrangefrom6.0to8.5.Theoptimaltemperaturefortheenzymewas75 andoptimalpHwas7.5,respectively.Keywords:

4 glucanotransferase,

large ringcyclodextrin,

separationandpurification,

enzymaticproperty

收稿日期:2009 07 15

基金项目:2007国际科技合作计划项目(2007DFA31120);江苏省自然科学基金创新学者攀登项目(BK2008003);

食品科学与技术国家重点实验室2008年度目标导向项目(SKLF-MB-200804);江苏省科技支撑计划项目(BE2008317)。

*通信作者:金征宇(1960-),男,江苏扬州人,教授,工学博士,博士生导师,主要从事碳水化合物研究。

Email:jinlab2008@http://doc.guandang.net

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环糊精(cyclodextrin,CD)是由芽孢杆菌属(Bacillus)的某些种产生的葡萄糖基转移酶(CG Tase)作用于淀粉而生成的一类环状低聚糖,其中最常见的是聚合度分别为6、7和8的 、 和 环糊精[1-2]。区别于上述环糊精的大环糊精是指聚合度从9到几百不等的环状葡聚糖[3-4],由于其复杂的空穴结构、高水溶性、低黏度和不回生等特性,可以广泛地用于食品、化学、医药工业中,越来越多的学者开始关注并致力于大环糊精的研究[5-8]。

环糊精的生产通过生物酶法进行的,即由微生物来源的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase,EC2.4.1.19)转化淀粉而得,其中用于制备大环糊精的酶是4 糖基转移酶(4 GTase,EC2.4.1.25)[12-13]。该酶是一个多功能性酶(Naka muraetal.1994),属于 淀粉酶家族[3,14],可以作用直链淀粉使其发生环化反应,生成 1,4 葡聚糖,即大环糊精(Takahaetal.1996,1998)。尽管从众多微生物或植物中都可以得到该酶[9,15-16,21],但是由于其在生物体内的含量很低,无论是作为研究来源还是用于制备大环糊精,都不能满足需求。国外对产大环糊精的糖基转移酶的研究已经进行了几十年,而国内仅近几年才开始进行研究于产大环糊精酶的研究成果很少。

作者利用实验室保存的一株基因工程菌E.co liDH 5 TA发酵产4 CGTase,对该酶进行了分离、纯化和鉴定,并对其酶学性质进行了初步研究,为该酶进一步的研究以及大环糊精的生产提供了理论依据。

[4,19]

[7,17]

[2,9-11]

1 1 4 主要设备 SW CJ 1F双人单面超净工作台:苏州安泰空气技术有限公司产品;LS B50L自动立式电热压力蒸汽灭菌锅:上海华线医用核子仪器有限公司产品;3K30冷冻离心机:SIGMA公司产品;JYD 650超声波细胞粉碎机:上海三信仪器有限公司产品;纯泰PURIBESTNi NTA亲和层析

柱:生物医药纯化技术公共服务平台;SDS PAGE电泳仪:伯乐公司产品;HPLC:LC 20AT(包括二元泵,手动进样器,柱温箱,示差折光检测器),日本岛津公司产品。1 2 方法

1 2 1 菌体的收集

1)种子培养 将稳定表达的基因工程菌种从平板上挑取单菌落接种至装有80mL种子培养基的500mL三角瓶中培养,设置摇床转速为200r/min,37 培养12h。

2)摇瓶发酵培养 将培养好的种子培养基按照2%(体积比)的接种量,接种至装有80mL发酵培养基的500mL三角瓶中,设置转速200r/min,37 发酵培养10h。

3)收集菌体 将发酵完成的菌液于10000r/min离心10min收集菌体,用50mmol/LTris HCl(pH7 5)洗涤细胞两次,彻底去除残余培养基,上清液即为粗酶液。

1 2 2 粗酶液的制备 将湿菌体充分均质,冰浴超声。程序为超声波功率400W,处理2s,间隔5s,循环100次。然后将其混合液于4 ,10000r/min离心10min,上清液即为粗酶液[17]。

1 2 3 酶活分析 碘比色法:准确吸取250 L质量分数0 2%直链淀粉(DMSO),置入10mL比色管中,加50 L质量分数1%麦芽糖(Tris HCl,pH7 5),600 L50mmol/LTris HCl(pH7 5),摇匀。于75 水浴预热10min,准确加入0 1mL酶液,摇匀,立即计时,于75 水浴准确保温酶解反应10min,立即取出100 L反应液加入到900 L稀碘液,摇匀即可终止反应。以稀碘液为空白,620nm波长下测吸光度[18]。

酶活定义:在测定条件下,10min内吸光度每下降0 1为一个酶活单位。1 2 4 目标酶的分离纯化

1)酶的初步纯化 将粗酶液置于65 处理20min,然后4 、10000r/min离心10min,取上清液

[10]

,对

1 材料和方法

1 1 材料

1 1 1 菌种 重组E coliDH 5 TA,带有p6 HTAaGTAmp质粒(质粒为韩国首尔国立大学

Kwan HwaPark教授提供)。

1 1 2 培养基LB斜面培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5,NaCl10,琼脂20,氨苄青霉素0 1,pH7 5;LB种子培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5,NaCl10,氨苄0 1,pH7 5;LB发酵基本培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5,NaCl10,氨苄0 1,pH7 5。

1 1 3 主要试剂 低相对分子质量标准蛋白:14400~97400,分析纯,重庆升博科技有限公司产品;SDS PAGE试剂:分析纯,北京经科宏达生物技术有限公司产品;麦芽糖标样、三(羟甲基)氨基甲烷:分析纯,国药集团化学试剂有限公司产品。

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