高糖和氮源对鼠李糖乳杆菌乳酸发酵的影响

第3 6卷第4期 2 0 0 6年1 2月

工业微生物I n d u s t r i a l Mi c r o b i o l o g y

Vo l . 3 6 No . 4De c . 2 0 0 6

高糖和氮源对鼠李糖乳杆菌( L a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u s )L 一乳酸发酵的影响李海军，林建群‘,林建强，曲音波，董锡文(山东大学生命科学学院，微生物技术国家重点实验室，济南 2 5 0 1 0 0 )

摘要

鼠李糖乳杆菌经实验室耐高糖高酸选育，能够在高糖浓度下高效高产 L一乳酸。以酵母

粉为氮源和生长因子，葡萄糖初始浓度分别为1 2 0留 L和1 4 6岁 L,摇瓶培养1 2 0 h, L一乳酸产量分别为1 0 4以 L和1 1 7 . 5岁 L, L一乳酸得率分别为8 6 . 7%和8 0 . 5%。高葡萄糖浓度对菌的生长和乳酸发酵有一定的抑制。增加接种量，在高糖浓度发酵条件下，可以缩短发酵时间，但对增加乳酸产量效果不明显。乳酸浓度对鼠李糖乳杆菌生长和产酸有显著的影响。初始乳酸浓度到达7 0留 L以上时，鼠李糖乳杆菌基本不生长和产酸，葡萄糖消耗也被抑制。酵母粉是鼠李糖乳杆菌的优良氮源，使用其它被测试的氮源菌体生长和产酸都有一定程度的下降。用廉价的黄豆粉并补充微童维生素液，替代培养基中的酵母粉，可以使产酸浓度和破源得率得以基本维持。关键词： L一乳酸；鼠李糖乳杆菌；发酵

乳酸广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，乳酸及其盐类， 4旨类在食品、医药及化学工业等领域

复合氮源当中，酵母粉对于乳酸菌的生长和 L一乳酸

具有广泛的用途〔 1 - 3 1,需求量也在逐年增加。目前全世界的乳酸产量已超过 1 0万t,预期到2 0 1 0年，产量可突破 1 0 0万t,将可由精细化学品一跃而成为大宗日用化学品。

发酵是最理想的[ 9 - 1 2 1。然而，酵母粉成本较高，其费用会达到总生产费用的3 0%以上[ 8, 1 3, 1 4 1。因而，减少酵母粉用量或寻找廉价的复合氮源替代酵母粉具有重要的经济价值。我们曾经对利用造纸废料生产 L 一乳酸和乳酸

乳酸分子中具有不对称 C原子，因此有 L -, D -乳酸两种旋光异构体及 D L -乳酸外消旋体。由于人体只具有分解 L一乳酸的酶，故人体只能代谢 L一乳酸，因此在用于食品及医药工业时必然要用

L一乳酸

发酵动力学进行了细致的研究〔 i s - 2 0 1。本文将利用工艺优化的方法[[ 2 i 1,着重研究鼠李糖乳酸杆菌在高糖浓度下高效高产 L一乳酸的影响因素，并优化氮源组成，寻找酵母粉的替代物，进一步降低生产成本。

代替D L一乳酸[]。’而最具应用潜力的是用 L一乳酸为原料生产聚乳酸( P L A ),制造生物可降解性塑

1材料与方法1 . 1菌种、培养基及培养方法

料[ 1 5 1 .有统计资料表明，日本现在每年需要生物可降解塑料 0 . 3万t; 2 0 1 0年 1 0万t;到2 0 2 0年需要

菌 种：鼠李糖乳杆菌( L a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u s )L l l,经过高葡萄糖、高乳酸液体培养基传代培养与平板分离的初步菌种选育。

1 5 0 0万t;全世界 1 0 0 0 0万t;每年以1 4%的增长率增长[[ 6 1。由此可见， L一乳酸的市场潜力巨大，发展前景十分诱人。乳酸杆菌是优良的生产 L 一乳酸的细菌，但它在高糖浓度下会受到抑制并且它对营养要求苛刻，需

MR S培养基(岁 L ):葡萄糖 2 0,蛋白脉1 0,牛肉膏1 0,酵母粉 5,乙酸钠 5,柠檬酸按 2, M g S 0 47 H 2 0 0 . 1, K H 2 P O 4 2, Mn S O 4 H Z O 0 . 0 5,吐温 8 0

要添加多种氨基酸和生长因子[[ 7, 8 1,在所有研究的作者简介：李海军( 1 9 7 8一),男，硕士研究生。,通讯作者。E一二l: j i a n q u n l i n )s d u . e d u . c n

1 m L, p H 6 . 5, 1 1 5℃灭菌2 0 m i n a

第4期

李海军，等：高糖和氮源对鼠李糖乳杆菌任a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u s ) L一乳酸发酵的影响40 20

第3 6卷

发酵培养基( g/ L ): M g S O 4 7 H 2 00 . 2, K H 2 P O 40 . 3,长H P q0 . 3, Mn S O 4 .玫 00 . 0 3, F e S O 4 . 7践O

0 . 0 3,另外加一定量的葡萄糖作为碳源以及酵母粉 (曰锄 )翻 曰 断 .闷

00

或其它含氮物质作为氮源(详细说明见下文); p H5 . 5一6 . 0; 1 1 5℃灭菌2 0 m i n。

80 60

叶酸2维生

素混合液：阉m L,烟酸 5 m g/ m L,泛酸钙 3 m g/ m L,盐酸毗哆醇 0 . 5 m g/ m L,生物素 2 0 p g/ m L,对氨基苯甲酸2 m g八 n L,盐酸硫胺素 5 m g/ m L,核黄素0 . 5 m g/ m L . 5摇瓶培养： 0 0 m L摇瓶装 2 0 0 m L培养基；接种前添加经过干热灭菌的C aC O3,终浓度为 1 0%;接种量为 5%; 4 2℃, 1 2 0 r/ m i n培养。 1 . 2分析方法每隔一定时间取样， 样品分成两份，一份经 8 0 0 0订 m i n离心 1 0 m i n,取上清，立即置于一 2 0℃冰箱储存以备分析；另一份用 5 m o l/ L盐酸溶解其中的C a M,经8 0 0 0 r/ m i n离心 1 0 m i n去上清，菌泥重悬于无菌水中，稀释至一定浓度，于波长 6 2 0 n m测光吸收( 7 2 2型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂),并根据标准曲线计算菌体干重。葡萄糖和 L 一乳酸的定量分析，采用 S B A - 4 0 C型生物传感分析仪测定(山东省科学院生物研究所，山东济南)。

404 8 7 2

时间( h )

10: 80. 501 20. 90 60 30 0

2结果与讨论2 . 1高糖浓度及其相关因素对 L .乳酸发酵的影响

葡萄糖浓度为1 4 6岁 L时的乳酸产量和得率超过了

H o f v e n d a h l K .等【,〕报道的结果，接近K w o n S .等〔 8 1报道的1 5 0以 L葡萄糖转化成 1 2 5 g/ L的L一乳酸的

产量和得率。高糖浓度下，菌在高渗条件下生长需 以巧g/ L的酵母粉为氮源，选择不同的初始葡代谢较慢，导致发酵周期延萄糖浓度，分别为1 2 0 g/ L, 1 4 6 g/ L, 1 7 8 g/ L, 2 0 8 g/要一个较长的适应过程，

L,以摇瓶进行发酵实验。乳酸生产和葡萄糖消耗分别见图1 . 较高的葡萄糖浓度下，分批发酵可以获得较高的乳酸浓度，但发酵周期较长。糖浓度越高，对菌的生长和产酸速率的抑制也越强，但对菌的最大浓度

长，乳酸生产缓慢，得率低，以及发酵液中残糖高。虽然最高产酸达到1 1 7 . 5岁 L,接近国内外报道的最高水平，但高糖抑制作用明显，有进一步改进的潜力。

没有显著影响。初始葡萄糖浓度 1 2 0留 L,发酵 9 6 h,残糖浓度为零，乳酸产量达到

1 0 3 . 5留 L,得率为8 6 . 2%。随着初始糖浓度的提高，发酵周期也相

应地延长。初糖浓度分别为 1 2 0留 L, 1 4 6留 L, 1 7 8创 L和2 0 8岁 L时，发酵 1 2 0 h,乳酸产量分别为1 0 4, 1 1 7 . 5, 1 1 5 . 5, 1 0 2 g/ L, L一乳酸得率分别为8 6 . 7%, 8 0 . 5%, 6 4 . 9%, 4 9 . 0%,随糖浓度的升高依次下降。

增加接种量有助于加速菌体生长，克服生长延迟现象，或许能够缓解高糖的抑制作用。为此，分别选择5, 1 0和1 5%三种不同的接种量，葡萄糖浓度分别为 1 4 6和2 0 8岁 L,氮源为 1 5留 L的酵母粉，进行了摇瓶乳酸发酵实验，结果见图2 0由图2 可见，在高糖浓度下，加大接种量，在一定程度上可以促进菌体生长、糖消耗和产酸速率；但仍无法克服高糖的抑制作用。在2 0 8刁 L初始葡萄

(〕谕 )稗 擂 牌

4 8 7 2

9 6 1 2 0

时f i l ( h )

图 1高糖浓度下乳酸发酵时间曲线 一今-1 2 0 g/ L一. -1 4 6 g/ L一▲-1 7 8创 L一x -2 0 8留 L

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