最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 内参基因软件使用方

内参筛选与分析,亲试最好用教程!

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法[1-2]。实时荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量，在进行相对定量分析时不需要已知量的标准品，因而该方法被经常运用，但该方法需要用内参基因对目的基因进行数据校正，才能获得精确的结果[3-4]。

肌动蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPD H）、18S rRNA、转录延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被当作内参基因进行使用[5-8]。然而，越来越多的研究表明，在某种试验稳定表达的内参基因，在另一种试验中有可能是变化的[9-11]，而在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在[12-13]。如果仅仅根据文献报道使用某个常用的内参基因，不仅可能导致试验结果的不准确性，甚至可能导致结论的错误。因此，本着严谨的科学态度，科研工作者首先必须从众多的内参基因中筛选出在各自试验条件下较为稳定的内参基因。

geNorm、NormFinder和BestKeeper是专门用于筛选内参基因稳定性的软件，但这3种软件的使用方法和分析的侧重点各不一样，为了让相关科研人员快速了解并掌握这3种软件的使用方法，笔者结合自身使用这些软件的经历，详细介绍了这3种软件的使用要点，以期为相关科研人员分析内参基因稳定性提供便利。

1geNorm软件

1.1软件概述

geNorm软件是Vandesompele等[14]在2002年编写的专门用于实时荧光定量PCR中筛选内参基因及确定最适内参基因数目的程序，该程序可以用于筛选任何试验的任意数目的内参基因，并最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，可使相对定量的结果更为精确。geNorm 程序通过计算出每个内参基因稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异V值，并根据V n/V n+1值来确定所需最适内参基因的数目。默认的V值为0.15（该值可以人为稍作调整），如果V n/V n+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n个；而如果V n/V n+1值>0.15，则最适内参基因的数量是n+1个。

1.2操作流程

1.2.1修改Excel表格安全性级别。若geNorm软件打开后不能正常运行时，可能是由于Excel表格默认宏的安全性级别设置的比较高，这时需要将Excel表格安全性级别更改到最低级别。更改方法为点击Excel表格中的“工具”按钮，然后点击其下拉菜单“宏”的子菜单“安全性”选项，在弹出来的“安全性”对话框中将安全级别设置为最低。

1.2.2计算△Ct值。先找到该基因在所有样品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表达量最高），再用其他样品的Ct值减

利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性

分析的方法

吴建阳1何冰1杜玉洁1李伟才2魏永赞2*

（1岭南师范学院基础教育学院，广东湛江524037；2农业部热带果树生物学重点实验室，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所）摘要实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方

法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。

关键词内参基因；稳定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper

中图分类号S60文献标识码A文章编号1007-5739（2017）05-0278-04

Analysis Method of Systematically Evaluating Stability of Reference Genes Using geNorm，NormFinder and BestKeeper WU Jian-yang1HE Bing1DU Yu-jie1LI Wei-cai2WEI Yong-zan2*（1Basic Education College of Lingnan Normal University，Zhanjiang Guangdong524037；2Key Laboratory of Tropical Fruit Biology（Ministry of Agriculture），South Subtropical Crops Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences）Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology（RT-qPCR）is used for gene expression analysis with high sensitivity，good repea-tability，strong specificity，high throughput，but the veracity and reliability results depend on whether select appropriate reference gene or not.However，no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results，appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each experimental system.geNorm，NormFinder and BestKeeper are useful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis，but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to use them and provide convenient for new researchers，this study described the methods of application.

Key words reference gene；stability analysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper

基金项目海南省自然科学基金（20163107）；中央级公益性科研院所

基本科研业务费专项（1630062016009）；现代农业产业技术

体系建设专项资金（CARS-33）；湛江市非资助科技攻关计

划项目（2016B01106）；岭南师范学院青年项目（QL1514）；

湛江师范学院青年项目（QL1116）。

作者简介吴建阳（1986-），男，江西南城人，硕士，讲师。研究方向：植

物栽培与分子生物学。

*通信作者

收稿日期2016-12-29

农村经济学现代农业科技2017年第5期278

内参筛选与分析,亲试最好用教程!

图2Excel 中加载NormFinder 软件后的菜单栏

去最低Ct 值，从而得到△Ct 值，该值≥0。

1.2.3计算2-△Ct 值。获得每个样品每个基因的△Ct 值

后，利用Excel 中的函数计算出相应样品相应基因的2-

△Ct 值，该值就是每个候选内参基因的相对定量数据，也是

进行geNorm 软件分析时要用到的数据。

1.2.4制作Excel 表格。在利用geNorm 软件分析时是将已

经处理好的各个候选内参基因的相对定量数据保存在一个新的Excel 表格中，再把Excel 表格导入geNorm 程序中。而这个Excel 表格中对于基因和样品的排列位置是有特定要求的，要求规定第一列为试验的样品（样品数量至少在2个以上，样品数量越多结论越可靠），第1行为欲筛选的内参基因，第1列第1行的单元格必须是空的，其他单元格的数据是在步骤1.2.3中计算得到的基因相对表达量的数值。

1.2.5内参基因稳定性和合适内参基因数目的确定。关闭

所有Excel 程序，启动geNorm 程序，点击菜单栏中的“Load in …… 此处隐藏：12634字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……