研究生药物色谱分析课程中的高速逆流色谱实验

研究生药物色谱分析课程中的高速逆流色谱实验

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药学服务与研究 PharmCare&Res 2009Jun;9(3)

周婷婷,等.研究生药物色谱分析课程中的高速逆流色谱实验

#经验交流#

研究生药物色谱分析课程中的高速逆流色谱实验

周婷婷,闻 俊

1,2

1,2

,范国荣

1,2*

(1.第二军医大学药学院药物分析教研室,上海200433;2.上海市药物代谢重点实验室,上海200433)[关键词] 色谱分析;高速逆流色谱;教育,药学;研究生课程

[中图分类号] R924 [文献标识码] B [文章编号] 167122838(2009)0320238203 药物色谱分析是高等学校生物医药及食品等相关专业硕士研究生的一门学位课程,其主要内容是阐述色谱分析方法原理及其在药学研究中的应用,并介绍色谱分析相关领域最新进展。随着科学技术的迅猛发展,药物色谱分析的新技术也不断涌现。高速逆流色谱(high2speedcounter2currentchromatography,HSCCC)是近10年迅速发展起来的新型液2液分配色谱技术。它依靠聚四氟乙烯(PTFE)蛇形管的方向性及特定的高速行星式旋转产生的离心场作用,使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管中,并使流动相单向、低速通过固定相。在短时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中高速分配,继而达到连续逆流萃取分离物质的目的。与其他分离手段相比,HSCCC不用固相载体作固定相[1],并具有分离纯度高、样品回收率高、适用范围广、可一步制备纯品的优点,既适用于小量分析,也可用于大规模纯化,在生物、医药、天然产物化学、环境分析、食品等领域有广泛的应用[2,3]。特别是在天然产物有效成分的分离、纯化、制备方面显示出强大的优势[426]。在我国的高等院校中,目前使用的药物色谱分析实验教材中很少包含HSCCC的内容。为使研究生了解科学前沿和掌握最新技术,有必要在药物色谱分析课程中介绍这种新的色谱技术。

本文内容为作者科研成果的一部分[7]。采用HSCCC技术,通过优化分配系数筛选最佳两相溶剂体系,快速分离纯化中药栀子中的主要活性成分栀子苷。本实验操作过程简单,分离时间适宜(5学时),可在一般实验室内完成。该实验容易被教师和学生所接受,可作为高等学校生物医药及食品等相关专业的药物色谱分析HSCCC实验教学内容。1 实验目的

了解HSCCC的基本原理、特点和仪器基本构造;理解HSCCC两相溶剂体系的选择原则;掌握HSCCC分离、纯化天然产物活性成分的操作步骤和方法。2 实验原理

2.1 基本概念 分配系数、分离度和固定相保留率按以下公式计算。

分配系数(K)=

化合物在两相溶剂上相中的浓度

化合物在两相溶剂下相中的浓度

取市售中药栀子500g打成粗粉,用10倍量50%乙醇回流提取2次,每次2h,过滤,合并滤液,60e减压浓缩至稀浸膏,真空干燥得栀子粗提物,得率为29.8%。取上述栀子粗提物,加水混悬后总体积为2000mL。加入到装有1500g经预处理过的D101大孔吸附树脂层析柱上,上样完毕后吸附2h。用6000mL水洗脱,弃去洗脱液,再用6000mL20%乙醇洗脱,乙醇洗脱流分减压浓缩后,真空干燥(60e),得提取物粉末29.51g,得率为5.9%。HPLC色谱条件为:LichrospherC18色谱柱(250mm@4.6mm,5Lm);流动相为乙腈B1%醋酸水溶液=10B90;流速0.9mL/min;柱温25e;检测波长238nm。经HPLC检测,栀子苷和京尼平212B2D2龙胆双糖苷的保留时间分别为2.2 实验原理 在逆流色谱中,最关键和最难的一步是优选合适的两相溶剂体系,好的溶剂体系应满足以下要求:(1)两相的分层时间<30s;(2)所分离化合物在两相体系中的分配系数应接近1;(3)所用固定相应有较高的保留率;(4)所分离化合物与其他化合物之间的分离度应>1.5。3 仪器和试剂

TBE2300A型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司);多层聚四氟乙烯螺旋管柱(直径2.6mm,总体积300mL,B值为0.5~0.8,R值为5cm)、SixstarNS21007恒流泵(流速为0~9.99mL/min)和8823A紫外检测器由北京市新技术应用研究所提供;手动进样阀(天津高新科技公司);HX1050型恒温循环水浴系统(北京博医康实验器具公司);N2010色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)。旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);FAI604电子天平(上海天平仪器厂);SK5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);DJ204B中药粉粹机(上海淀久中药机械有限公司);DZF26020真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、乙酸均为分析纯(上海五联化学试剂厂);乙腈(色谱纯,德国Merck公司);重蒸馏水(第二军医大学药学院自制);栀子(上海童涵春堂中药饮片厂)。4 课前实验准备

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(No.30801541)[作者简介] 周婷婷(19802),女(汉族),博士,讲师.E2mail:ting0618@http://doc.guandang.net

*

分离因子(A)=化合物a的分配系数

化合物b的分配系数

保留在柱子中的固定相体积

固定相保留率=@100%。

通讯作者,E2gucn

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表1 不同溶剂体系中栀子苷与京尼平212B2

D2龙胆双糖苷的分配系数

分配系数K

溶剂体系

栀子苷

乙酸乙酯2正丁醇2水(2B1B3)乙酸乙酯2正丁醇2水(1B4B5)乙酸乙酯2正丁醇2水(1B1B2)乙酸乙酯2正丁醇2水(1B2B3)乙酸乙酯2正丁醇2水(10B1B10)正丁醇2水(1B1)氯仿2甲醇2水(4B3B2)正丁醇2冰乙酸2水(4B1B5)

0.951.350.670.650.250.541.442.87

A2.161.301.051.423.131.743.512.39

11.8和17.3min,两者的总含量为95.3%。5 实验内容

5.1 溶剂体系筛选 分配系数的测定:在10mL玻璃试管中,分别准确加入等量(各4.0mL)的已平衡好的上、下两相,再向试管中加入一定量(约2.0mg)的样品后,充分振摇,使试管中的两相充分混合,也使样品在两相中充分溶解与分配。之后静置分层,分取上下相,减压挥干溶剂后,用适当溶剂溶解并定容至适当体积,取少量经微孔滤膜过滤后进行HPLC分析,上、下两相平行操作。读取上、下两相流分相应色谱峰的峰面积,用上相溶剂中相应色谱峰的峰面积除以下相溶剂中相应色谱峰的峰面积即得分配系数(K),由分配系数计算分离度(A)。

根据所分离的环烯醚萜苷化合物在不同溶剂体系中的溶解性能,测定两种化合物在正丁醇2水(1B1)、氯仿2甲醇2水(4B3B2)及不同配比的乙酸乙酯2正丁醇2水(2B1B3、1B4B5、1B1B2、1B2B3、10B1B10)溶剂体系中的分配系数值,测定结果见表1。由表1中K值及A值综合考虑,最终选择乙酸乙酯2正丁醇2水(2B1B3)作为分离纯化栀子苷和京尼平212B2D2龙胆双糖苷的两相溶剂体系。在分液漏斗中配制该溶剂体系,充分振摇后静置分层,分取上下相,以上相为固定相,下相为流动相。

5.2 HSCCC分离 首先将固定相以10mL/min的流速泵入到逆流色谱的分离管中,待出口有液体流出,表明所泵固定相已经充满了分离管,再将流动相以流速为2.0mL/min

京尼平212B2

D2龙胆双糖苷

0.441.040.700.920.080.945.051.12

泵入。同时打开主机电源,将分离管正向旋转,转速为800r/min;打开检测器,设定检测波长254nm;打开色谱工作站,设定相关参数。同时接收流出液体,直到流动相流出分离管(即接收容器中出现明显的溶剂分层),表明两相溶剂体系在分离管中建立了动态平衡,逆流色谱柱体积为300mL,固定相保留率60%。取上述大孔吸附树脂纯化物粉末300mg溶解于10mL下相中,由进样阀进样。进样体积一 …… 此处隐藏：6490字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……