讲稿8-蛋白质分析技术

蛋白质工程

第八章 蛋白质分析技术

第一节 蛋白质的鉴定

一、蛋白质含量与纯度检测

●蛋白质的检查、测定及分析工作：

蛋白质总量、特定蛋白质的含量、鉴定、纯度。

方法：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚法

紫外吸收法等。

●特定蛋白质→→→用高度特异性的生物学方法：

具有酶或激素性质的蛋白质→→→利用酶或激素活性测定含量。

利用抗体—抗原反应→→→测定特定蛋白质的含量。

名词：提纯程度 特定蛋白成分与总蛋白之比。 名词：比活性 每毫克蛋白质含多少活性单位。

●纯度鉴定：用分辨率高的物理化学方法，

如电泳分析、沉淀分析、扩散分析等。

恒溶解度法

◤纯蛋白质在一定溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖存在于溶液中未溶解固体的数量。

◤在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。 ◤如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在折点以前，直线的斜率为1，在折点以后，斜率为零。

◤不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个以上的折点。

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溶解的蛋白质的量

加入的固体蛋白质的量

任何单一鉴定只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件

而不是充分条件 Why?

---很少有蛋白质能够全部满足各种鉴定的严格要求，

---在一种鉴定中表现为均一的蛋白质，

--在另一种鉴定中又表现为不均一的了。

二、分子量测定

蛋白质相对分子质量： MW

6 000～1 000 000 或更大一些。

1．渗透压（osmotic pressure）

公式：π/ c = RT / M + K c π：渗透压 c：溶质浓度

R：气体常数 T：绝对温度 M：分子量

---同时测定几个不同浓度的渗透压，

---以π/ c 对 c 作图并外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出 M。 ---在溶解度允许的范围内，采用等电点或接近等电点的缓冲液，增高溶液中无机盐的浓度，避免 pH 值的影响。

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---在 10,000 至10,0000 范围测蛋白质分子量。

---装置简单，准确度高。不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。

2．沉降平衡（sedimentation equilibrium）

▲沉降的速度与颗粒大小成正比。 ▲超速离心机达750 000r/min以上， ▲离心力超过重力4000 000倍。 ▲分析用的超速离心机装有光学系统， ▲记录沉降进行时蛋白质界面的位置。

▲当溶液中所含的分子形状和大小相同时，则这些分子以相同速度移向离心管底，在溶质与溶剂之间产生清晰的界面。

▲当溶液含有数种分子大小不同的蛋白质时则产生数个界面，每个界面存在一种蛋白质。

▲从光学系统观察沉降界面可以得出蛋白质的沉降速度。

名词：沉降系数(sedimentation coefficient S ) 当沉降面以恒速移动时，每单位离心场的沉降速度，或沉降常数沉降系数。 一个S单位为1×10－１３/s。

蛋白质的沉降常数S（20℃，水中）约 l×10－１３～200×10－１３，或1S～200S。

沉降系数S = 单位(cm)离心场里的沉降速度

dx / dt

= —————

w2 x

由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对

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分子质量。

[M=RST/D〔1－iρ〕

R：气体常数；T：绝对温度；D：扩散系数；ρ：溶剂的密度]

沉降平衡公式：

2RT ln(c2/c1) M = ——————————

(1-v ρ) ω2 (x22-x12) x：蛋白质界面到旋转中心的距离

c： x 处的蛋白质浓度

ρ；溶剂的密度 ω：角速度

v：蛋白质的偏微比容（partial specific volume）

3．凝胶过滤层析（gel fitration chromatography）

◆在层析柱中装入葡聚糖凝胶珠(如Sephadex)， ◆内部为多孔网状结构，具有大量微孔。

◆一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许较小的分子进入胶粒，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。

◆洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；

◆小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。 ◆用已知相对分子质量的蛋白质校准凝胶柱，

◆从被测样品在洗脱时出现的先后位置计近似的相对分子量。 公式：log M = K1-K2Ve Ve：洗脱体积

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---先测出几种标准蛋白质的

Ve ，以它们的 log M 对 Ve 作图，得标准曲线，

再测出待测样品的 Ve ，即可从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。

---用己知和蛋白质作标准，求出K1、K2 ---由待测样在同一凝胶柱上的Ve，求出其Mr ---待测样品与标准蛋白质具有相同分子形状。

---样品可以是不纯的。只要它具有专一的生物活性，借助活性找出洗脱峰位置，确定它的洗脱体积就能测定它的分子量。 4．SDS-PAGE

SDS处理过的蛋白质放在含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，其蛋白质的迁移率与其相对分子质量成反比，

用已知相对分子质量的标准蛋白质进行校准，即可得出所测蛋白质的相对分子质量。

蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）

用SDS和巯基乙醇处理，蛋白质变性，与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物

蛋白质分子均带负电（SDS带负电）

荷质比相同

[蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少] 不同蛋白质分子具有相似的构象 公式： logM = K1-K2 µR

样品迁移距离

µR（相对迁移率）= ——————————— 前沿（染料）迁移距离

以几种标准单体蛋白质分子量的 logM 对其 µR 值作图，

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根据待测样品的 µR ，从标准曲线上查出它的分子量。

5．激光解吸电离飞行时间质谱 （LDI-TOF-MS）

（laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry） ---高度纯化的蛋白质样品与有机酸混合，在靶金属表面干燥。

---激光发出的光线使蛋白质离子化。这些离子经过加速后，飞入自由漂移区，最后到达检测器。

---飞行时间与分子量成反比，与电量成正比。

---可以测定 10-15 ~ 2×105 MW 的蛋白质，误差仅为 0.0001。

6．根据化学成分测定最小相对分子质量

用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分(元素)的百分含量； 假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量Mr；

已知成分的相对分子、原子质量

Mr＝ ———————————————————

已知成分的百分含量

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如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。

例如，用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe 0.34％，则最低Mr=55.84×100/0.34=16700。用其它方法测定，

其实际Mr为16700的4倍，

因此，血红蛋白含有4个Fe的原子。

三、等电点测定 1. 溶解度法（ …… 此处隐藏：4860字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……