实验一、RNA提取方法及原理

实验一、RNA提取方法及原理

一、研究背景二、方法及原理

一、研究背景1. RNA研究的重要性 DNA,RNA和蛋白质是三种重要的生物 大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的 遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在 信息传递中起很重要的作用。其它两大类 RNA,rRNA和tRNA,同样在蛋白质的生物 合成中发挥不可替代的重要功能。因此 mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传 递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足 轻重。

不同丰度

组织名称 肝脏

样品 量1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg

总RNA含量

2 RNA分布

高丰度

脾脏 心脏 大脑 胚胎 肾脏 肺

2-4μg

中丰度

0.05-2μg

膀胱低丰度 骨 脂肪 高丰度 中丰度 低丰度 成纤细胞 人白细胞 酵母 拟南芥叶片 烟草叶片 玉米叶片

1mg1mg 1mg 105 105 105 1mg 1mg 1mg 0.5-1μg 0.5-1.5μg 0.2-0.5μg 0.05-0.1μg 0-0.05μg

二、方法及原理1 、 RNA的提取流程(1)样本前处理 (2)细胞裂解 (3) RNA的纯化及获得

RNA提取流程-- 样品前处理注意点

选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜组织，生长旺盛的组织

选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞

RNA提取流程-- 样品前处理中如何保存样本

可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol,-70℃保存较长时间

推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存

液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间

RNA提取流程--细胞裂解，以释放RNA

异硫氰酸胍/酚-TRNzol总RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂

RNA提取流程-- RNA的纯化及获得RNA纯化要求

1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质

2 排除有机溶剂和金属离子的污染3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染

2. RNA提取的注意事项 杜绝外源酶的污染 a.严格戴好口罩，手套。 b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆， 电泳槽，实验台面等要彻底处理。 c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须 确保 RNase-Free。

阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。 b.选择合适的裂解液。 c.控制好样品的起始量。

明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时， 抽提成功率急剧下降。 b.RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实 验的一次成功，而不是得率。

Rnase 污染的10大来源1:手指头 2:枪头 3:水/缓冲液 4:实验台面 5:内源 Rnase 6:RNA 样品7:质粒抽提 8: RNA 保存 9:阳离子 (Ca, Mg) 10:后续实验所用的酶

复习核酸的提取方法 RNA的提取 苯酚水溶

液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90%苯酚水溶液振 荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖(水层); DNA、Pro(苯酚层) 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂

复习核酸的提取方法 DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，+含少 量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA-Pro,再用浓盐提 取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro

复习核酸的提取方法 核酸的沉淀 DNA的等电点4-4.5,RNA的等电点2-2.5. 收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异 丙醇沉淀。 在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也 能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析 出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇 能沉淀出蛋白。