灵芝孢子粉对荷HAC肝癌小鼠抗肿瘤的实验性研究

5上海免疫学杂志62000年第20卷第2期文章编号:1001-2478(2000)02-0101-03

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灵芝孢子粉对荷HAC肝癌小鼠抗肿瘤的实验性研究

陈雪华,朱正纲

上海第二医科大学附属瑞金医院,上海消化外科研究所 上海 200025马安伦,余奇文

上海第二医科大学 上海市免疫学研究所 上海 200025

摘要:本文通过荧光细胞检测技术、体外细胞毒试验以及肿瘤抑瘤率的测定,观察了灵芝孢子粉对荷HAC小鼠T细胞表面分化抗原,体外细胞杀伤功能以及肿瘤抑瘤率的影响。结果显示灵芝孢子粉治疗组中总T细胞的百分率(6314%)高于对照组(5613%),其中对总T细胞、T辅助细胞的上调较为明显。在对HAC、YAC-1和P815肿瘤细胞的杀伤活性中灵芝孢子粉组的杀伤活性分别为2713%、2314%和2010%,高于对照组。灵芝孢子粉组的总抑瘤率为4212%。结果表明灵芝孢子粉是一种能激活和提高特异性(CTL)和非特异性杀伤细胞(NK、LAK)的抗肿瘤作用,抑制肿瘤细胞的增殖以及调控机体免疫功能的中药。

关键词:灵芝孢子粉;小鼠HAC肝癌;环磷酰胺中图分类号:R28515 文献标识码:A

ExperimentalStudyontheAntitumorEffectofGanodermaLucidum

ChenXuehua,ZhuZhenggang(ShanghaiInstituteofGastricDigestion,RuijinHospital,ShanghaiSecondMedicalUni-versity,Shanghai200025);MaAnlun,YuQiwen(ShanghaiInstituteofImmunology,ShanghaiSecondMedicalU-niversity,Shanghai200025)

Abstract Theant-itumoreffectofGanodermalucidumspore(GLS)wasstudiedbyusingmicecarryingHAChepaticcancerasananimalmodelforseachforaspecifictherapeuticwaywithlowside-effect1Bymeansofimmunofuorescence,invitrocytotoxicitytestingandassayfortumorgrowthinhibition,theinfluencesofGLSontheexperssionsofsurfacediff-entiationantigensofTcells,invitrocytotoxicityactivitiesandratesoftumorgrowthinhibitionwereobserved.ItwasfoundthatthenumbersoftotalTcellsinmicerecievedGLSwerehigherthanthatofthecontrolmice(6314%vs5613%),especiallythetotalnumberofTcellandtheup-regulationofThelpercells.ThepercentagesoftumorgrowthinihibitiononHAC(whichisCTL-specifickilling),YAC-1(NKsensitive)andP815(NKnon-sensitive)were2713%,2314%and2010%respectively,whichwerehigherthanthoseofthecontrolmiceandmicetreatedwithCTX1ThetotaloftumorgrowthinhibitionrateinmicerecievingGLSmayapproachupto4212%1ItsuggestsGLSmaybeanant-itumortraditionalmedicinewhichcanactivateandenhancethespecific(CTL)andnon-specific(NK,LAK)cytotox-icityactivities,inhibitthetumorgrowthandregulatestheimmunefunctionsofthehost.Keywords ganodermalucidumspore;HACmurinehepaticcancer;CTX 从中医中药中寻找和研究抗肿瘤新药是令人关注的方向。灵芝孢子是一种富含多糖肽和有机锗的中药。已有报道灵芝的多糖肽能破坏癌细胞的端粒酶,从而有效地杀伤癌细胞。同时能调节并提高机体的细胞、体液免疫能力以及强化自身的抗癌和防癌能力。有机锗可从癌细胞中夺取电子,使其电位下降,从而抑制肿瘤的血管形成,使之生长和转移受到抑制[3,4]。本文报道灵芝孢子粉对荷HAC小鼠抗肿瘤作用的实验性研究。

[1,2]

1 材料和方法

111 主要试剂 灵芝孢子粉(广州生物研究所)。丝裂霉素C、环磷酰胺(CTX)(上海第十二制药厂生产)。MTT(Sigma),ConA(Fluka)。rIL-2(Boehringer)。抗小鼠T细胞单克隆抗体[抗Thy112(CD3),抗L3T4(CD4),Lyt2(CD8)](华美公司)。

112 实验动物 雌性BALB/c纯系小鼠,5~6周

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5上海免疫学杂志62000年第20卷第2期

龄,20?2g体重,购自中科院上海实验动物中心。荷HAC肝癌种鼠,购自中科院药物所。

113 肿瘤细胞株 小鼠白血病细胞株YAC-1,小鼠肥大细胞性白血病细胞株P815(引自美国ATCC),由本室常规传代培养。

114 肿瘤接种 无菌获取传代接种HAC肝癌的BALB/c种鼠的肿瘤组织,除去包膜,剪碎组织,200目滤网过滤,用无菌生理盐水稀释HAC细胞至5@106/ml,每只小鼠左腋下接种012ml[5]。115 实验分组 生理盐水组:从接种HAC肿瘤细胞当天起,每只小鼠每天腹腔注射生理盐水012ml,连续30d。环磷酰胺组:从接种HAC肿瘤细胞的第1、7、14天,每只小鼠腹腔注射012mg(20mg/kg)环磷酰胺。灵芝孢子粉组:从接种HAC肿瘤细胞当天起,每只小鼠每天腹腔注射的灵芝孢子粉水溶液012ml(011mg/ml),连续30d。

116 小鼠脾细胞悬液的制备 将不同组别的荷瘤小鼠处死,无菌获取脾脏。将脾脏置100目滤网上轻轻碾碎,分别过滤成细胞悬液。1000r/min,5min洗涤细胞。用1640培养液还原细胞至4ml左右,轻轻铺于小鼠淋巴细胞分离液(比重11088)上,离心2000r/min,20min。吸取单个核淋巴细胞(PBL),1000r/min,5min洗涤细胞二次。用1000u/mlIL-2,30%FCS的1640培养液调整PBL浓度为2@106/ml,待用。

117 小鼠HAC肝癌细胞的制备 取无溃疡的荷HAC肝癌小鼠一只处死,无菌取下肿瘤组织,去除脂肪和结缔组织。用机械方法获取细胞。洗涤1000r/min,5min。细胞经小鼠淋巴细胞分离液(比重为11065)的分离,离心2000r/min,20min,吸取肿瘤细胞,1000r/min,5min,洗涤二次。计数。用1640培养液调整肿瘤细胞为1@106/ml,待用。118 小鼠CTL的诱导 小鼠HAC肝癌细胞经丝裂霉素C(最终浓度为25Lg/ml)处理,置37e水浴,30min,1000r/min,5min,洗涤细胞二次。用1640培养液调整肿瘤细胞浓度为2@105/ml,待用。在24孔板上每孔加入小鼠脾脏淋巴细胞悬液1ml(2@106/孔),经丝裂霉素C处理的小鼠HAC肝癌细胞悬液1ml(2@105/孔),使淋巴细胞B肿瘤细胞为10B1,用最终浓度为500u/mlIL-2,15%FCS的1640培养液于37e、5%CO2培养14d。在第7天再次每孔加入经丝裂霉素C处理的HAC肝癌细胞015[6]

119 小鼠CTL的T细胞表面标志检测 采用本室建立的常规免疫荧光法及流式细胞仪分析[7]。1110 小鼠CTL的杀伤功能检测[8] 取出培养14d的CTL细胞,离心1000r/min,,5min。经小鼠淋巴细胞分离液(比重为11088)分离,离心2000r/min,20min。吸取CTL细胞,计数,调整到5@10/ml细胞浓度。加入96孔板内,100Ll/孔(5@105/孔细胞)。将体外传代培养的HAC、YAC-1和P815靶细胞离心1000r/min,5min。调整细胞浓度为215@10/ml。加入预先加有CTL细胞的96孔板内,100Ll/孔(215@10/孔细胞)。效应细胞B靶细胞为20B1。每孔最终体积为200Ll。将96孔板置37e、5%CO2培养箱内培养24h。离心1000r/min,5min。吸弃上清,加入MTT50Lg/孔。37e再培养4h。每孔加入100Ll酸化异丙醇,充分混匀,静置数分钟。于590nm读取A值。统计CTL细胞对HAC、YAC-1以及P815肿瘤细胞的杀伤百分率。1111 瘤重与瘤体积的测量 第30天处死各组动物,取瘤称重,从测得的肿瘤最大直径(a)和横径(b)按下列公式求出体积V[5]:

V(cm3)=

3114@ab

6

治疗组肿瘤重量(或体积)4

5

6

计算抑瘤率:

抑瘤率=1-

总抑瘤率为重量及体积两组抑瘤率的均数。

2 结果

211 灵芝孢子粉对荷HAC肝癌小鼠免疫功能的影响 表1显示环磷酰胺组的小鼠总T细胞、T辅助细胞和T杀伤细胞均低于生理盐水组。而在灵芝孢子粉治疗组中T细胞数量高于生理盐水组。

表1 灵芝孢子粉对荷HAC肝癌小鼠T细胞亚群表型的影响组别生理盐水组环磷酰胺组灵芝孢子粉组

动物(n)

666

Thy112 5613?7165012?8156314?516*

L3T4 3615?3153111?319*4112?411*

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