临床医学1,25(OH)2D3抑制肝癌细胞HDAC2活性和促进p21 WAFICIP1(3)

含指示剂溴酚蓝）相混匀。

3)用移液器将混合物小心加入样品槽中，第一孔点样Marker DNA，记录好

点样次序及样品量。

4)盖上电泳槽并通电使DNA向正极泳动。

5)待指示剂泳至凝胶前沿1～2cm处，切断电源并取出制胶板 ,凝胶成像仪

上观察凝胶，记录结果。

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2.8 肝癌细胞HepG2核蛋白的提取

（1) 试剂盒中的三种试剂于室温融解，溶解后立刻放置冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞核蛋白抽提试剂，在使用前数分钟内加入PMSF 使PMSF的最终浓度1mM。

(2) 从培养箱取一瓶处于对数生长期的肝癌细胞HepG2，弃去细胞培养基后用PBS 3ml洗涤细胞两次后用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打及离心收集细胞，留下细胞沉淀备用。

(3) 根据沉淀的量按比例加入临时添加PMSF的浆蛋白提取试剂A（20ul:200ul）。

(4) 以最高的速度Vortex 使细胞沉淀完全悬浮分散开，时间为5秒。

(5) 冰浴14分钟。

(6) 冰浴后使加入10ul的浆蛋白抽提试剂B的溶液以最高的速度剧烈涡旋5秒，之后冰浴1分钟。

(7) 冰浴后以最高的速度涡旋5s，接着4℃离心机以 12000-16000g/5min。

(8) 马上把上清(细胞浆蛋白)吸出放入预先冷置的5mlepp管中。把50ul的核蛋白抽提试剂加入剩下的沉淀中。以最高的速度涡旋 25s，使细胞得沉淀完全悬浮分散开。之后放回冰浴中，每隔2分钟再高速涡旋25s,整个过程共30分钟。

(9) 放入4℃的离心机离心12000-16000g/10min。

(10) 马上把上清(细胞核蛋白)吸出放入预先冷置的5mlepp管中。可以马上使用，也可以-70℃冻存。

2.9 BCA蛋白浓度测定

(1)蛋白标准溶液(25mg/ml)配置：蛋白标准配制液和BSA配置比例(0.8ml：20mg）。

(2)把蛋白标准溶液浓度稀释至0.5mg/ml。

(3) 依据样品数量，按BCA试剂A与BCA试剂B按50:1的比例配制适量BCA工作液，充分混匀（如5ml BCA试剂A加100ul BCA试剂B),混匀，配制成5.1ml BCA 工作液。 BCA工作液室温24小时内稳定。

（4）将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 2096孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul。

(5) 加适当的体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20ul。

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15 (6) 各孔分别加入200ulBCA 工作液，37℃放置30分钟。注: 也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟（BCA 法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应会因温度升高而加快。）。

(7) 测定A562，540-595nm 之间的波长也可接受。根据标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。

2.10 SDS －PAGE 电泳

1、 安装制胶板

(1)用洗洁精清洗制胶玻板和胶槽，自来水冲洗至玻板至不再挂水珠再用去离子水冲洗3遍，最后室温晾干。

(2)在桌面上安装制胶装置，上锁扣时注意玻板底部平整对齐，并与海绵紧密接触（注意在安装过程中不要用手接触玻板中部，以免污染玻板）。

2、 制胶

(1)准备2个小烧杯，用洗洁精清洗后，依次用自来水、蒸馏水和去离子水冲洗。

(2)根据样品分离的要求，按表 4.1 配制分离胶，按表中的配方依次加入各溶液。注意丙烯酰胺溶液有神经毒性，取液时应该佩戴手套，取液前振荡试剂瓶。并观察试剂情况。

按下表配制 10% SDS-PAGE 分离胶所用溶液

配制不同体积和浓度凝胶所需要各成分的体积/ml

成分 10% 12%

去离子水（Deionized water ） 1.9 1.6

30%丙烯酰胺贮备液 1.7 2.0

1.5 mol/L Tris 溶液（pH 8.8） 1.3 1.3

10 %十二烷基硫酸钠（SDS ） 0.05 0.05 10% 过硫酸铵（APS ） 0.05 0.05 TEMED 0.002 0.002

(3)TEMED 最后加入，加入后立刻用 1 ml 的移液器吹打混匀溶液（并注意不要吹打出气泡）。

(4)将混匀的聚丙烯酰胺溶液沿胶板边缘快速注入胶板中，液面到预定位置后，换成ddH 2O 覆盖，室温放置 20-30 min 。

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16 (5)按照下表配制积层胶液，根据表中配方依次加入各溶液，10%APS 和 TEMED 最后加入。

配制不同体积和浓度凝胶所需要各成分的体积/ml

成分 5%

去离子水（Deionized water ） 2.1

30%丙烯酰胺溶液 0.5

1.5 mol/L Tris 溶液（pH6.8） 0.38

10 %十二烷基硫酸钠（SDS ） 0.03

10% 过硫酸铵（APS ） 0.03 TEMED 0.003

(6)30 min 后，将分离胶上面的ddH 2O 倾倒掉，用滤纸吸干板边缘的水。

(7)在配好的积层胶溶液注入胶板中并将梳齿插入积层胶上部（插入的深度根据上样需求决定）。室温放置 20-30 min ，凝固后将胶板放入电泳槽中。

(8)将电泳缓冲液加入槽中（注意尽量平稳加入，减少气泡产生）。

3. 样品制备

(1)根据样品的蛋白浓度,按比例加5³LB 。4℃ 15000 rpm 离心5min ，取上清转移至新的epp 管中。

(2)100 ℃加热 5 min 。

4、 蛋白质电泳

(1)将梳齿从积层胶中拔出(如果加样孔弯曲可用注射针进行调拨)。

(2)样品离心完后，将epp 管按加样顺序排列逐个用移液器和20μl tip 头上样。

(3)连接电极端口（注意连接正负极正确），打开电泳仪电源，设置电泳参数（积层胶电泳 80 mV ，分离胶电泳 120 mV ，总时间 2.5 h ）。电泳过程中应该注意观察条带压缩情况、电泳速度及电压的稳定情况，当条带进入分离胶时注意切换电源。

5、 胶的剥离

(1)当溴酚蓝电泳至胶末端时，停止电泳。

(2)卸下电泳装置，用纯水清洗胶板，剥离尺缓慢撬开玻板（注意不要撬动边角

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处）。

(3)然后用剥离尺将PAGE胶轻轻撬起用于转膜放入转移液中。

6.转膜

（1）准备1张pvdf膜和6张滤纸，根据膜的大小切出同等大小的pvdf膜和滤纸。

（2）在加有转移液的盘里放入转膜用海绵、6张滤纸和pvdf膜。

（3）将转膜夹子打开使黑色的一面保持水平。在上面放一张海绵，在海绵上放三层滤纸。

（4）剥胶，撬玻璃板的时候动作要轻，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶，调整其与滤纸四边距离，放于滤纸上面并与之对齐。在分离胶上放上pvdf膜，再盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上海绵垫。

（5）将转膜夹放入加入转膜缓冲液的槽中,转膜时会产热，注意降温。一般用250mA转移 2.5h 。

7. 免疫反应

（1）将膜用 TBS 浸湿后，移至封闭液中，于摇床上封闭1h。

（2）将一抗用 TBST 稀释，将抗体溶液加到保鲜袋中；从封闭液中取出膜，将膜放于保鲜袋中，4度过夜，隔天从4度冰箱取出放在摇床上1h，一抗孵育后室温下加TBST在摇床上洗三次，每次 8min；

（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，摇床孵育 1h 后，室温下用TBST 在摇床上洗三次，每次8min。

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