临床医学1,25(OH)2D3抑制肝癌细胞HDAC2活性和促进p21 WAFICIP1(2)

1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制

1） 30%丙烯酰胺溶液：

丙烯酰胺（Acrylamide） 29.0g

亚甲双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide） 1.0g

用dddH2O定容至100ml的棕色瓶存于4℃。

2) 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-Hcl ( PH 8.8）

Tris 18.15g

1mol/L HCL 调节PH

用dddH2O 定容至100mL，4℃保存

3) 浓缩胶缓冲液1.0mol/L Tris-Hcl (PH 6. 8）：

Tris 12.1g

1mol/L HCL 调节PH

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用dddH2O 定容至100mL，4℃保存

4) 10% SDS溶液：

SDS 10.0g

用dddH2O定容至100ml，室温保存

5） 10%过硫酸铵（AP）：

过硫酸铵 0.1g

dddH2O定容至1.0ml，4℃保存

6）TEMED 遮光保存，分装于EP管冻存

7）5³SDS-PAGE Loading Buffer配制方法：

DTT （二硫苏糖醇）（0.1M） 1.54g

SDS（sodium dodecyl sulfate） 2.0g 1M Tris-HCL（pH6.8） 8.0mL 溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至20mL

8）电泳液缓冲液

Tris（MW121.14） 3.03g

甘氨酸（MW75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后于室温保存

9）转膜缓冲液

甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后4度保存，

10)TBS缓冲液

1 mol/L Tris²HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

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9 蒸馏水至 1000ml

11)TBST 缓冲液

20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

现用现配。

12)封闭液

脱脂奶粉 5g

TBST 100ml

现配现用

2、实验方法：

2.1细胞培养

2.1.1 细胞培养基:

肝癌细胞HpG2为贴壁细胞。用高糖DMEM 培养基含10%胎牛血清于5% CO 2、37℃

恒温培养箱培养。

2.1.2细胞传代

在细胞贴壁生长达80%～90%融合度时进行传代，首先弃旧培养液，用于37度温育的PBS 洗涤细胞1-2次（根据细胞培养液干净程度决定），加入1mL 0.25%胰蛋白酶液在显微镜下观察，观察细胞的胞质出现回缩，细胞之间的空隙逐渐增大后立即加入含10%胎牛血清的高糖的DMEM 培养基3ml 来终止胰蛋白酶液的消化。用枪头吸取瓶内的混合液，反复轻柔的把细胞从瓶壁上吹打下来。待细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液，分装入2个25 cm 2的培养瓶中，加培养液至每瓶6mL ，置于37℃，5% CO 2 培养箱中培养。

2.1.3细胞复苏

1）从液氮罐中取出有肝癌细胞HepG2细胞株的冻存管，立即投入37℃水中水浴，并不时轻轻摇动，使其尽快解冻。

（2）用75%的酒精棉花擦拭冻存管壁后，将其置于超净工作台上，打开管盖，用无菌玻璃吸管吸出细胞悬液转入15ml 灭菌离心管中，再向离心管中加入约8ml 细胞培养基，轻轻吹打悬浮细胞。

（3）1000r/min ，离心5min ，弃去上清。

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10 （4）加入含10%胎牛血清及含谷氨酰胺的DMEM 高糖培养基，用移液器轻轻吹打混匀后移入细胞培养瓶中。

（5）将细胞培养瓶置于含5%二氧化碳孵箱中37℃培养，每1-2天更换细胞培养基。

2.1.4细胞冻存

冻存前一天换液，取对数生长期的细胞，胰酶消化后1000rpm 离心，加入细胞冻存液(90%FBS,10%DMSO)1ml ，吹打均匀后放入细胞冻存管，转移至程序降温仪中，4小时后投入液氮中。

2.2 CCK-8检测1,25（OH ）2D 3对肝癌细胞抑制作用

2.2.1实验分组

正常对照组：10%FBS 的高糖DMEM

乙醇对照组：10%FBS 的高糖DMEM ＋无水乙醇（浓度小于0.01%）

实验组： V1：10%FBS 的高糖DMEM ＋10-6mol/L1,25（OH ）2D 3

V2: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-7mol/L1,25（OH ）2D 3

V3: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-8mol/L1,25（OH ）2D 3 V4: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-9mol/L1,25（OH ）2D 3

V5: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-10mol/L1,25（OH ）2D 3

2.2.2 cck-8检测步骤

（1）在24孔板里培养肝癌HpG2细胞，分别于一周内每天天消化细胞进行计数，得出细胞生长曲线。 （2）取处于生长对数期的肝癌细胞，在96孔板中接种细胞悬液（8³103/孔），将96板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO 2）。

（3）细胞贴壁后，对实验组和对照组进行饥饿培养3H ，后根据实验分组，加入1,25（OH ）2D 3培养细胞，设无细胞组为空白对照组，每组设5个复空，分别于

24,48和72小时后向每孔加入10 μL CCK 溶液和90ul 的细胞培养基。

（4）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

（5）用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

2.3 HepG2细胞RNA 的提取

采用RNAprep Pure Cell Kit 提取HepG2细胞总RNA ，操作步骤按RNAprep Pure Cell Kit 试剂盒说明书进行。实验过程所用物品用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC ）

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11 浸泡，进行去RNA 酶处理。

（1）细胞加药后分别于24H,48H 和72H 弃去细胞培养液，用PBS 3ml 漂洗细胞两次后用胰蛋白酶处理。

（2）当细胞间间隙变大时，加入含有血清的培养基后将细胞溶液转移至RNase-Free 的离心管中，300³g 离心5 min ，收集细胞沉淀（仔细吸除所有上清）。轻弹离心管底部使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL 并旋涡震荡。

（4）将含有RL 的细胞沉淀转移至过滤柱CS 上，12000 rpm 离心2 min 后收集滤液。

（5）向滤液加入1倍体积70%乙醇混匀（此时可能会出现沉淀），于CR3吸附柱中加入得到的全部滤液， 12000 rpm 离心30-60 sec ，将倒掉废液的吸附柱CR3放回收集管中。

（6）向吸附柱CR3加入350μl 去蛋白液RW1，12000 rpm 离心30-60 sec ，将倒掉废液的吸附柱CR3放回收集管中。

（7）DNase I 的配制：取10μlDNase I 放入RNase-Free 离心管中，加入70μl RDD 溶液轻柔混匀。向吸附柱CR3中央加入80μl 的DNase I 工作液，室温放置15min 。

（8）向吸附柱CR3加入350μl 去蛋白液RW1，12000 rpm 离心30-60sec ，倒掉收集管的废液并将吸附柱CR3放回收集管中。

（9）向吸附柱CR3加500μl 漂洗液RW ， 室温静置2 min ，12000 rpm 离心30-60 sec ，倒掉收集管的废液并将吸附柱CR3放回收集管中。重复步骤9。

（10）12000 rpm 离心2 min ，倒掉废液后将吸附柱CR3置于室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（11）将吸附柱CR3转入新的RNase-Free 离心管中，加入30-100μl RNase-Free 的ddH2O 室温放置2min ，12000rpm 离心2 min ，得到RNA 溶液。

（12）加入适量的DEPC 水溶解RNA 沉淀。

（13）总RNA 的纯度及完整度检测：取2μlRNA 溶液加于198μlddH 2O 中，紫外

线分光光度计检测在26Onm 和28Onm 的吸光度。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定提的总RNA 的完整 …… 此处隐藏：2883字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……