临床医学1,25(OH)2D3抑制肝癌细胞HDAC2活性和促进p21 WAFICIP1

贵阳医学院2014届硕士研究生论文

《中国图书资料分类法》单位代码：10660分类号：R 学号：S110145

贵阳医学院

2014届硕士学位论文

1,25(OH)2D3抑制肝癌细胞HDAC2活性及促进p21 WAFI／CIP1表达的研究

研究生：孔维莹

导师：黄韵祝教授

年级：2011级

专业：临床检验诊断学

2014年 5月9日

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贵阳医学院2014届硕士研究生论文

目录

摘要 (3)

前言 (4)

材料与方法 (5)

结果 (18)

讨论 (29)

结论 (32)

参考文献 (32)

英文摘要 (33)

致谢 (36)

略缩词表 (37)

学位论文原创性声明 (38)

附：综述 (39)

2

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1,25(OH)2D 3抑制肝癌细胞HDAC2活性及促进

p21 WAFI ／CIP1

表达的研究

专 业：临床检验诊断学 研究生：孔维莹 导 师：黄韵祝 教授

摘要

目的：

本课题通过研究1,25(OH)2D 3对肝癌细胞中组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）的抑制作用和细胞周期蛋白的表达情况，探讨1,25(OH)2D 3是否通过抑制HDAC2表达来促进了p21 WAFI ／CIP1高表达，致使人肝癌细胞株停滞于GO/GI 期，从而调节肝癌细胞的增殖和分化。 方法：

本课题首先培养人肝癌细胞株（HpG2）,用CCK-8试剂盒检测1,25(OH)2D 3对细胞的增殖抑制作用，得出1,25（OH ）2D 3对肝癌细胞的抑制率的趋势；在不同时间点和不同浓度梯度用1,25（OH ）2D 3来处理细胞，提取细胞的核蛋白和RNA ，并用RT-PCR 技术检测p21WAFI ／CIP1 和HDAC2的mRNA 水平，用Western blot 印迹技术检测HDAC2和p21WAFI ／CIP1 蛋白的表达。 结果：

1、CCK-8试剂盒检测显示1,25（OH ）2D 3对肝癌细胞有抑制作用，并随着加药时间的延长和药物浓度的增加，抑制率呈现明显升高趋势，且各浓度实验组和对照组比较，差异都具有统计学意义。

2、用核蛋白试剂盒和RNA 提取试剂盒成功提取出加药组.乙醇组和对照组的核蛋白和RNA 。

3、RT-PCR 检测出在加药后的24H ，48H ，72H 随着1,25（OH ）2D 3浓度的增高，HDAC2的mRNA 表达水平呈降低趋势，各时间点的对照组和实验组差异有统计学意义;加药后的24H ，48H ，72H 随着1,25（OH ）2D 3浓度的增高，p21WAFI ／CIP1的mRNA 表达水平呈升高趋势。

4、Western blot 印迹技术检测在加药后的24H ，48H ，72H 随着1,25（OH ）2D 3浓度的增高，HDAC2的蛋白表达水平呈降低趋势，各时间点的对照组和实验组差

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4 异有统计学意义;加药后的24H ，48H ，72H 随着1,25（OH ）2D 3浓度的增高，p21WAFI

／CIP1的蛋白表达水平呈升高趋势。

结论：

1、1,25（OH ）2D 3对肝癌细胞的增殖有抑制作用。

2、1,25(OH)2D 3在mRNA 表达水平是抑制HDAC2表达和促进了p21 WAFI ／CIP1高表达。

3、1,25(OH)2D 3在蛋白表达水平是抑制HDAC2表达和促进了p21 WAFI ／CIP1高表达

关键词：1,25(OH)2D 3；HDAC2；p21 WAFI ／CIP1

前 言

1,25(OH)2D 3在很多方面对体内有作用，主要通过维生素D 的受体（VDR ）的介导

产生生物学效应，最基本的是钙磷代谢，还可以促分化、抑制肿瘤的浸润及转移和抗增殖等作用，维生素D 受体（VDR ）有多个功能区，其中C 区和E 区位则是VDR 的主要功能区，有研究发现，1，25（OH ）2D 3抑制肿瘤细胞生长的重要机制

是通过抑制肿瘤细胞周期并使其停留在细胞周期的G1期，与此同时S 期细胞数目下降，则发生G1期的阻滞。真核生物的细胞周期是由一系列调控因子的有序的聚合和激活组成，调控因子中cyclin 和CDKI 以CDK 为中心，前者促进细胞增殖，后者抑制细胞增殖共同调节细胞周期的演进[1,2]。p21WAF1/Cip1是属于CDKI 中的Cip/Kip 家族，作为一种广谱的CDKI ，其最初是为p53的下游基因被发现，其定位于第6号染色体短臂上，DNA 长度为85kb ，由3个外显子构成，正常细胞中有其表达，并与肿瘤发生密切相关，在肿瘤的演进过程中可与cyclin 和CDK 结合，使cyclin —CDK 复合物的激酶活性丧失，因此细胞周期停滞于G1期[3,4,5]；抗肿瘤药物设计中的靶标与抑制基因转录及促基因沉默有关的是组蛋白去乙酰化酶(HDACs)，组蛋白的乙酰化及去乙酰化的修饰是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和HDAC 共同催化的[6,7]。在正常的生理状态下，组蛋白乙酰化作用在HAT 与HDAC 的调控中处于平衡状态，而细胞发生转化的状态时HDAC 的活性明显增强，则使得基因表达平衡状态被打破，于是导致细胞周期的分子表达失衡和抑制基因转录

[8.9.10]大量研究已证实了在肿瘤的发生及发展中组蛋白高/低乙酰化起着重要的作用，其中一些基因（调节细胞周期和凋亡）对染色质组蛋白的乙酰化高度敏感，研究发现胃癌细胞系中p21 WAFI ／CIP1基因表达失活的主要机制是组蛋白脱乙酰化

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[11,12]

，丁酸盐和曲古抑菌素A 通过抑制脱乙酰化和增强乙酰化而上调p21 WAFI ／CIP1

基因的转录[13-15]。这些研究结果说明：癌细胞中的p21 WAFI ／CIP1基因的表达受组蛋白乙酰化调控。 有研究报道1,25(OH)2D 3的抗肿瘤机制，但其确切分子机制至今仍未阐明；也有研究发现：1,25(OH)2D 3抑制肿瘤细胞生长的重要机制是1,25(OH)2D 3通过VDR 介导调节CDKI 及抑制CDK 复合物的活性，诱导多种类型的

细胞停留在细胞周期的G1期，发生G1期的阻滞，其中p21 WAFI ／CIP1

基因是调节细

胞周期的抑制蛋白CDKI ，大量研究已证实VDR 介导1,25(OH)2D 3通过上调p21和p27（周期素依赖性激酶抑制因子)来发挥生物学效应，抑制cyclin-CDK 复合物的活性及使Rb 蛋白去磷酸化，并使E2F 转录活性降低，最终肿瘤细胞停滞于G0/G1期，从而调节肿瘤细胞的增殖和分化[16]，Sari Toropainen 等研究发现1,25(OH)2D 3在下调人类MYC 基因时同循环辅助因子和组蛋白乙酰化有关，1,25(OH)2D 3通过VDR 介导与MYC 基因的VDRS 上的作用位点结合，VDRS 作用位点其中包括HDAC2、HDAC6、HDAC11[17]。据文献[17]数据得出1,25(OH)2D 3在下调MYC 基因时作用的位点时和核蛋白VDR 结合的有TBL1X 、SMRT 、HDAC6、HDAC11，在1,25(OH)2D 3两个小时的作用下，通过RT-PCR 和SiRNA 技术得出HDAC2在沉默前后的MYC 基因的表达从1.2下降到0.8，则得出HDAC2结合位点对1,25(OH)2D 3反应较敏感。

本课题设想1,25(OH)2D 3发挥生物学效应可通过上调周期素依赖性激酶抑制因子p21 WAFI ／CIP1，而p21 WAFI ／CIP1基因的表达受组蛋白乙酰化调控，本实验选用人肝癌细胞株，研究 1,25(OH)2D 3对人肝癌细胞株细胞中HDAC2的作用，观察 p21WAFI ／CIP1的表达情况，观察1,25(OH)2D 3在促进了p21 WAFI ／CIP1 的蛋白和mRNA 表达升高的同时，是否抑制HDAC2表达，探讨1,25(OH)2D 3是否通过抑制HDAC2表达来促进了p21 WAFI ／CIP1高表达，致使人肝癌细胞株停滞于GO/GI 期，从而调节肝癌细胞的增殖和分化。

材料与方法 1、实验材料 1.1主要仪器设备

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