巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略

生物学 酵母表达

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海峡药学

20 0 7年

第1 9卷第 2期

巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略骆诗鸿 (门特宝生物工程股份有限公司厦门 3 0 0 )厦 5 0 5摘要：巴氏毕赤酵母(i ips r )达外源蛋白最理想的真核表达系统之一。 Pc a a os是表 h ti要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量·须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略必

关键词：毕赤酵母；高效表达；策略中图分类号： 9文献标识码： R2 A文章编号： 0 63 6 ( 0 7 0—0 40 1 0—7 5 2 0 ) 20 0 4

表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要内

达的各种因素，阐述了优化外源蛋白在 P psoi中高效并 .atr s表达的策略。1外源基因的内在特性

容，也是生命科学研究领域的热点。长期以来，肠杆菌一直大被用作表达外源基因的宿主菌，成功地表达了多种外源蛋并白，是它不能表达结构复杂的蛋白质，分泌型表达产量较但且低。哺乳类细胞、而昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，操作复杂，达水平低，业化生产但表产

主要包括 mR ’非翻译区 (’UT、因的 A+ NA 5端 5一 R)基 T组成和密码子的使用频率 3方面。 5一个’UTR的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达，于巴斯德毕赤酵母中乙醇由氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的 3%以上 )极少有 O,外源蛋白能达到这么高的水平，此为了有高的蛋白表达量，因维持外源基因 mR UTR。尽可能和 A NA 5 0Xl NA 5一 mR

造价昂贵，易普遍推广使用。酵母是单细胞低等真核生物，不 它既具有原核生物易于培养、殖快、于基因工程操作和高繁便密度发酵等特性，同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，能分泌外源蛋白到培养还液中，于纯化。因此，近 10多年来，利最 酵母被认为是一个很

UTR相似是必需

的，好是保持两者一致。A+ T含量高的最基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止， 这是因为 A丰富区可能存在转录提前终止信号。因此对 T AT含量丰富的基因最好是重新设计序列，其 A+ T含量使在 3%~ 5%范围内。这种方法使破伤风毒素 C片段得到 O 5用高效表达。P t通过对 1 0酵母基因使用密码子的统计 an等 1个学分析，证了密码子的偏爱性与基因的表达量密切相关。确在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。翔等通过分析巴斯德毕赤酵母的 2个蛋白编码基因的赵 8

有前途的真核表达系统而受到广泛的关注由于发酵和酿造工业的发展，人们对酿酒酵母的遗传背景和生物学特性研究

得比较透彻，其表达的安全性易被接受。因此，且酿酒酵母首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，而其表达重组蛋白然 有一定的局限性。于酿酒酵母的局限性，们用其他酵母菌基人

株构建了可高效稳定表达外源基因的新表达系统，甲醇营即

养型酵母表达系统。作为第 2酵母表达系统，代它克服了酿酒酵母表达系统的诸多不足，为国内外广泛应用的大量生产成

同义密码子使用情况，算出该酵母的密码子用法，确定出计并巴斯德毕赤酵母的 1 9个高表达优越密码子“。 2选择强启动子

外源真核或其他结构较为复杂的原核蛋白的一个较为理想的表达系统。毕赤酵母是一种单细胞真核生物，十年来被作为近真核表达系统而用于外源蛋白质的生产，为一种成功的表作达体系，优点在于：有强有力的甲醇氧化酶基因 ( X )其具 AO I

P p s r载体中最常用的启动子为 AO启动子，的 . at i os Xl它甲醇诱导性很强，此，它控制的外源基因通常能得到高效因由表达。也有人曾用 P和 P^启动子，二者的强度大大低 os但于 P。如果带有外源基因的载体通过双交换整合 P .psoi atr s的 AOX1因位置时， X1基因将被破坏。虽然基 AO AO X2和 AO基因

的序列同源性高达 9%, AO X1 7但 X1基因

启动子，严格调控外源基因的表达；高密度发酵培养，可能而且营养要求低，于工业化放大生产；利自身分泌的蛋白质非常少，高分泌的外源蛋白质便于纯化；源基因通过整合型质使外粒进入毕赤酵母染色体基因组，构稳定，易丢失}结不自身含有亚细胞器结构，对表达的蛋白质进行翻译后的修饰如信可号序列的加工；白质的折叠；硫键形成以及糖基化；因蛋二基表达的产物既可在胞内积聚，可分泌到胞外；源蛋白质的又外

表达产物在正常细胞中仅占总酶量的 5。这样就使细胞利%用甲醇的能力大大下降，而使表达下降且延长了细胞发酵从时间。了克服这一缺点，秀玉等通过分离选择恢复利用为戴甲醇能力的自发突变体， AOX1因缺陷菌株中分离得到从基 Mu+的自发突变体，们对突变体的 AO t他 X2基因上游区域经 P R扩增产物测序、定了该突变体在一 2 5和一 5 9两 C确 5 2

表达量较高，转化酵素 2 3·L_,溶菌酶 C, 5 如 .g。牛 O 5 g·L。溶栓酶 0 0g· I,淀粉酶 2 5一 .8 L。 A一 .g·L,胶裂解酶一果

0O4· . 0g L一。破伤风毒素片段 C 2 O L~,日咳抗原 1 . g·百P 93 O Lf,炎 B表面抗原 0 4·~,肝单胺氧化 6 .g·。肝 .g L人酶 B . g· 0 1 L一。文综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表本作者简介：诗鸿， (9 9 1一 )骆男 17 . O。毕业于福建师范大学生物工程学院职称；理工程师。主要从事生物制药。联系电话；3 50 5 4,助 1 90 5 2 1O 9— 6 l 58 5 2 5 1 5

个位置的碱基发生了改变，这两个位置为阻遏蛋白结合区而域。区域发生点突变后阻遏蛋白便不能很好地与之结合，该通过去阻遏作用使得转录效率增强，而提高表达量和缩短发从酵时间。。

3增加外源基因整合拷贝数外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因

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r a Vo No 2 2 0 tat h r cu i l u n l l1 . 0 7 c J 9的表达水平。一般情况下，源基因整合的拷贝数愈高，白外蛋 表达量愈大，表达鼠表皮生长因子 ( G时，如 mE F)多拷贝产生非常高的表达量。目前提高整合拷贝数的方法主要有： 1通 ()过不同的转化方法提高拷贝数。 . atr的转化方法有电激 P psoi s法、生质体法、化锂法等，中以原生质法转化使细胞群原氯其中产生多拷贝转化子频率相对较高 .若使用 G4 8检测拷但 1贝数，配合电激法转化的效果更好 . 2在体外载体上多次则 ()插入目的基因片段 .这种多拷贝整合不太稳定且拷贝数有但限 . 3将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高 ()重复的基因片段，过同源重组而达到高拷贝整合的目的。 通由于 r A在酵母基因组中有 10 2 0重复单元，以这是 DN 0~ 0个所一

Mu菌中分离 Mu自发突变体来使外源蛋白的表达量增 t t加。Ivt g n公司提供了 K 7 n io e r M 1和 G 1 5两种宿主菌株， S1 KM 7转化子是 Mu型， GS 1化子主要是 Mu表 1 t表而 1 5转 t型，有一小部分是 Mu。型。哪一种表型对外源蛋白的表也 t表达量更高，每一种蛋白而言是不确定的，此在 Mu+株对因 t菌中表达水平较低时，以尝试用 Mu型来表达。在 G l5可 t表 S l

中表达较低的可以尝试用 KM 7表达。 1来5优化发酵条件 5 1通气量、度、H、醇含量和培养时间等发酵条件 .温 p甲发酵条件主要包括通气量、度、H、醇含量和培养时间温 p甲.

等。养基的 p值和温度，于获得大量蛋白并具有生物活培 H对性非常重要。常，母的生长条件为 2~ 3℃,H …… 此处隐藏：3131字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……