微生物鉴定技术在药品检验及监管中的应用(简版)-徐 伟 东

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微生物鉴定技术在药品检验

和监管中的应用上海市食品药品检验所 徐伟东 2010年5月27

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微生物实验室能力建设一 二 三

背景介绍微生物鉴定技术平台的建设 样品微生物的鉴定及同源性分析 微生物新技术的应用

四 五

微生物污染监管方式的思考

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一、背景介绍 在1993-1998年间，美国FDA报告的由微生物污 染引起的召回案件达到1370件，占所有产品召回案 件的36% 我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染 仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受 微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法 挽回的损失。 药品安全管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、 应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现， 导致药品受到微生物污染 我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议 尤其是2010年在我国召开的上海世界博览会，也进 一步增强了对药品的监督管理水平的要求。

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传统微生物鉴定方法的局限

对微生物分类水平较低，只能鉴定 到“属”,鉴定微生物种类有限

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传统方法 人类已知的土壤微生物已达 到10万种 现在常用的微生物鉴定用生 化反应只有20多种，实际 经过研究形成一致标准的、 有意义的生化鉴定结果仅 2000多种。 微生物生化鉴定金标准的 API鉴定系统——仅能鉴定 550种细菌 通过碳源利用进行微生物鉴 定的Biolog系统也仅能鉴 定2000种微生物

分子方法 分子生物学技术研究的是 微生物DNA序列信息，常 用于细菌分类的16S r DNA也有1500个碱基， 每个碱基位置由ATGC四 种核苷酸中的一种组成， 多样性可达种可能(约) 10900。 新版的《伯杰氏系统细菌 学手册》微生物DNA变异 信息为主

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传统微生物鉴定方法的局限微生物变异能力强，生化反应准确 度不高，错检漏检现象普遍

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生化反应鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的 不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营 养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同“属” 微生物的酶系统基本相同，可以达到鉴定的目的微 生物DNA突变能力强，如果这些突变点涉及到微生 物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷， 导致鉴定失败 在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反应才会 被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反应的微生物 则被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关注 的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金黄 色葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球 菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、 社区食物中毒的重要污染源。

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传统微生物鉴定方法的局限

不能对

微生物污染进行准确溯源分析

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在进化过程中生物DNA分子会形成大量DNA多态性 区域和非编码DNA序列。 不会造成生物种属归类争议 也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变 通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析

DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进 化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是 微生物种内差异的来源

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如常用于真菌种类鉴定的ITS基因 ITS片段能保持相对稳定的变异频率 亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出 差异，显示最近的进化特征

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微生物实验室能力建设一 二 三

背景介绍微生物鉴定技术平台的建设 样品微生物的鉴定及同源性分析 微生物新技术的应用

四 五

微生物污染监管方式的思考

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2.1 技术手段 2.2 方法比较

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2.1 技术手段 2.2 方法比较

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2.1 技术手段微生物检测手段传统筛选方法 免疫凝集/免疫沉淀实验 Mini VIDAS筛选系统 荧光定量PCR(BAX) 革兰氏染色镜鉴 按照标准进行 传统的生化反应鉴定 API试剂条 菌鉴定国际金标准

微生物鉴定手段

半自动细菌鉴定仪 (ATB Expression)全自动细菌鉴定仪 (VITEK 2)

分子生物 学技术

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阳性菌分子水平上的鉴定4

GenBank12

PCR

分子杂交3

基因分型

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1.形态学鉴定2.生化鉴定 API

VITEK 16S rDNA序列分析

3.核糖体水平上 的鉴定 4.全基因组水平上 的鉴定

分子杂交(Dupont RiboPrinter)傅里叶红外光谱 Rep-PCR (DiversiLab)

5.脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序列分析(MLST),多位点重 复串联序列分析(MLVA),随机扩增多态性分析技术(RAPD)

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API试剂条——菌鉴定国际金标准

无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴 定，为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。

特点： 完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于550种 简单方便：标准化方法，成本低廉，判读结果简单 快速结果：4-24小时。

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半自动细菌鉴定仪(ATB Expression)

检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌 种和药敏试验(包括：肠杆菌、非发酵G(-)杆菌、 葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌)。可鉴定770 种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。

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原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊 度的菌液活化，于指定温度培养4小时/24小时后 即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相 应试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验 结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱 比较，以客观的2个参数(鉴定百分率及T-值)计 算鉴定结果 特点： 速度快捷ATB Expression提供自动化接种，阅 读及分析试条结果。

准确可靠的结果ID 32及快速ID 32 试条由金牌 标准API试条改良而成，配合自动化概念，结合成 完整的细菌鉴定系统