Cre_lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用(2)

为研究分析目的基因与启动子功能，本实验室成功构建了Cre/loxP重组激活系统［24］。该激活系统是建立在两个载体的基础上（图2），将pI-GFP和pGⅡ-GOI-HSCREN2 两载体共转入拟南芥中，筛选出共转化体。Hsp启动子经胁迫处理后激活Cre重组酶表达，Cre重组酶识别并删除同向重复的两个

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生物技术通报 Biotechnology Bulletin

2012年第5期

a. 目标基因组内Cre的稳定表达；b. Cre的瞬时表达

图3 Cre/lox重组系统的共整合［28

］

3.2 突变型 lox 位点的使用策略

其结构原理，如图5所示。

这个策略的重要组成部分是突变型lox位点的

使用。因为两个loxP之间的重组反应很容易可逆，这样两个loxP位点之间的整合反应往往不稳定。因此，为了稳定整合位点，研究者们构建了突变的lox位点，当loxP位点的左侧或右侧的两个反向重复序列内的4-7个碱基发生改变时，便产生了突变型lox位点。例如，左侧突变位点lox76和右侧突变位点lox75，它们是loxP的左侧和右侧序列分别有7个碱基发生了改变，当lox76与lox75发生重组反应时，就会产生一个野生型loxP位点和一个双突变lox位点［28］。双突变位点与lox75、lox76及loxP位点相比，反应活性会低很多，从而使整合更加稳定（图4）。Vega等［29］通过Cre/lox特异位点重组系统，利用loxP的突变体lox66/lox71提高了重组效率，实现了外源基因的定点单拷贝插入。此种策略还能够阻止质粒骨架整合进基因组［30］。对转基因植物来说，转入的质粒骨架是多余的元件，它的存在可能会诱导基因沉默［31］，通过该重组系统可将质粒骨架删除，

图 5 通 过两个lox位点重组产生不含载体骨架的

定点整合［30

］

3.3 RMCE策略

重组酶介导的盒式交换（recombinase-mediated

cassette exchange，RMCE），它主要利用重组酶对异种特异性位点的识别差异，通过两次相对独立的重组反应产生一种交换的效果，其优点是能够确保外源基因整合的高效性、定点可重复性和精确性。RMCE主要包括两种方式：基于Flp/FRT的RMCE和基于Cre/lox的RMCE。以Cre/lox为例，异种特异性lox位点是指在8 bp的间隔区内发生了碱基突变［32］，基于此原则，异种特异性lox位点有以下几对：loxP-lox511、loxP-lox257、loxP-m2、loxP-lox5171、loxP-lox2272等。一般来说，8 bp间隔区内单一碱基对的突变对重组反应效率的影响很小，但对反应的专一性的影响很大。例如，两个不同的间隔区突变体几乎不相容，而同一位点突变体却能发生高效的重组［33］。Cre介导的盒式交换的基本原理，如图6

a. lox位点左侧或右侧(LE or RE)反向重复序列中的4-7个改变的碱基；b. LE突变体与RE突变体重组后形成双突变体

图4 突变型lox位点的共整合［28］

年第期

陈广东等：Cre/lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用

所示。酶介导下，这些位点能表现出不同程度的活力；Cre基因的高度表达可能会导致基因重排等［37］。但是相信，随着技术的不断进步，Cre/lox特异位点重组系统将在基因工程中起到越来越重要的作用。

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图6 Cre介导的盒式交换［34

］

图6中靶位点含有一对异种特异性lox位点：loxP和lox2272。外源DNA片段中含有相同的一对异种特异性lox位点。由于loxP与lox2272的结构差异，Cre不能有效的介导分子内loxP与lox2272的切除反应。但能介导a和b两分子中相同的识别位点间 （即loxP与loxP或lox2272与lox2272间）进行重组。于是，两个lox位点间发生了双交换，使要整合进入的DNA片段替换了染色体的片段。

Louwerse等

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以loxP和lox5171为异种特异

性位点，首先将靶结构通过农杆菌介导的方法转化引入拟南芥基因组，靶结构含有方向相反的loxP位点和lox5171位点，这两个位点之间有bar编码区，可通过loxP外侧的35S启动子使loxP-bar表达。用于交换的T-DNA结构含有方向相反的loxP位点和lox5171位点，位点之间放置了一个无启动子的nptⅡ基因和gus基因。当Cre介导盒交换后，bar被高效表达的nptⅡ所取代，在含有卡那霉素的培养基上，重组子将被优先筛选，从而在拟南芥中实现稳定的RMCE。

4 结语

Cre/lox位点特异重组系统因其精确性和可预知性的特点，已经成为植物研究和生物技术产品商业化的有力工具，使人们定向、定点的对基因和染色。目前，虽然该系统还有些体进行操作成为可能［36］

不足，如植物基因组中含有一些潜在的、假lox位点，它们和野生型位点有部分的同一性，在野生型重组

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生物技术通报 Biotechnology Bulletin

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