RAW264_7细胞M1_M2亚型的诱导和鉴定

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RAW264.7细胞M1/M2亚型的诱导和鉴定

陈涛 梁潇 贺明 乌宇亮 袁祖贻

【摘要】 目的 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分化为M1/M2亚型，并分别根据其标志物的表达情况进行鉴定。方法 干预前一天以105

个/ ml密度铺好细胞，用不同浓度的IFN-γ+LPS干预，刺激分化为M1亚型；用不同浓度IL-4干预，刺激分化为M2亚型。分别于干预后12h提取细胞的总RNA。用realtime PCR方法对M1/M2亚型的标志物iNOS, CD86/MR（CD206），I型精氨酸酶(ArginaseI，Arg-I)进行mRNA水平表达量的鉴定，最终选择最合适的刺激浓度进行后续试验。结果 (1). 不同浓度干预试剂刺激12h后，大剂量干预组RAW264.7的细胞状态差，死亡细胞数多，中小剂量组细胞状态良好，完全贴壁，但细胞的形态发生改变；(2). 2.5ng/ml IFN-γ+200ng/ml LPS 共同作用12h后，RAW264.7的iNOS和CD86表达量最高，较基础水平有明显差异；(3). 10ng/ml IL-4作用12h后，RAW264.7的MR(CD206)和ArgI的表达量最高，较基础水平有明显差异。结论 用适当浓度的IFN-γ+LPS/IL-4刺激RAW264.7细胞12h，可使其分化为M1/M2亚型。

【关键词】 RAW264.7细胞；M1/M2亚型；炎症；动脉粥样硬化Introduction and Identi cation of M1/M2 Phenotype of RAW264.7 Cells

CHEN Tao1,LIANG Xiao1,YUAN Zuyi1,1Department of Cardiovascular Medicine,First Af liated Hospital,Key Laboratory of Environment and Gene Related Disease of Ministry Education,Xi’an Jiaotong University College of Medicine,Xi’an,710061,China.

【Abstract】 Objective To induce RAW264.7 cell line to M1/M2 phenotypes and identi cate the cytokines expressed on the surface. Methods Plating the cells in 12 wells plate as 105 / ml 24h before intervention and use IFN-γ+LPS to induce M1 phenotype,IL-4 to induce M2 phenotype, with different concertration. Extracting total RNA of cells after intervention. Detecting the surface marker iNOS, CD86/MR,(CD206),ArginaseI (ArgI) of M1/M2 phenotypes, respectively, by realtime PCR on RNA level to select the proper inducing concertration. Results (1). Cells retain well growth condition with inventional reagents of middle and smallest concertation but highest concertation; (2). iNOS and CD86 of RAW 264.7 cell increas-ing mostly after stimulated by 2.5ng/ml IFN-γ+LPS200ng/ml for 12h; (3). MR and Arg I of RAW 264.7 cell increasing mostly after stimulated by 10ng/ml IL-4 for 12h. Conclusion RAW264.7 cell can be induced to M1/M2 phenotypes after stimulated by proper concertration of IFN-γ+LPS/IL-

4,respectively.

【Key words】 RAW264.7 cell line; M1/M2 phenotypes; In ammation; Atherosclerosis(AS)

动脉粥样硬化（AS）被认为是慢性炎症性疾病［1］，巨噬径被诱导成为M2亚型后，则具有抗炎的作用［4］。在炎症的细胞参与了病程中脂质沉积到斑块破裂的所有过程［2］。目前，推进过程中，由于受到不同的细胞信号通路和细胞因子的调控对于巨噬细胞分型的研究成为该研究领域的热点，既往的研究和影响，M1/M2亚型的平衡一直处于动态变化中，向任何一认为在某些炎症性疾病中当巨噬细胞通过经典激活途径被诱导方的倾斜都决定了炎症的最终转归。根据已有的文献［5,6］，使成为M1亚型后，可促进炎症的进展［3］，而通过替代激活途

用iNOS和CD86，鉴定M1型巨噬细胞，使用MR和Arg I鉴定M2型巨噬细胞是经典方法，但是对于刺激剂量仍无统一的基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81025002；

标准，本研究旨在摸索出较为合适的刺激浓度，在细胞状态良No.30971219)；陕西省中医管理局资助项目《沙棘提好的基础上成功诱导出M1/M2巨噬细胞亚型。在AS中，如取物对apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化发生、发展能探明这一现象是否也符合上述研究的结论，则可以通过调控的作用研究》

M1/M2巨噬细胞比例，进一步影响AS的进展，为AS的治疗作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科；环境

提供了新的分子生物学靶点。

与疾病相关教育部重点实验室；陕西省分子心脏病学1 材料和方法

重点实验室

通讯作者：袁祖贻 Email: zuyiyuan@.

材料 小鼠巨噬细胞系RAW264.7由第四军医大学肿瘤生

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1

102 lirpA 2.oN 11 emuloV 志杂学病脏心子分国中

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基础研究

物学国家重点实验室保藏并惠赠；IFN-γ和IL-4 购于美国Perprotech公司；LPS购于美国Sigma公司；小鼠GAPDH，iNOS，CD86，MR和ArgⅠ引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于宝生

®

TM

照组△Ct(目的基因Ct-管家基因Ct)-各组△Ct(目的基因-管家基因Ct)。

2.结果

2.1 干预后RAW264.7的细胞形态改变：根据预定干预浓度对RAW264.7进行刺激12h后，电子显微镜下观察细胞的生长状态，发现LPS，IFN-γ以及IL-4的大浓度干预组细胞死亡较多，存活的细胞状态亦较差，与正常培养条件下的细胞相比，细胞形态变小变圆，大多呈现出细胞皱缩，也没有正常的伪足伸出且贴壁能力较弱。而中小剂量刺激组的细胞存活率高，细胞状态较正常培养情况下并无太多改变。（图１）

物工程（大连）有限公司；高糖DMEM培养基购于美国In-vitrogen公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；RNA提取试剂盒Fastagen200购于上海飞捷生物技术有限公司；RNA逆转录试剂盒购于美国Fermentas公司；其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。

方法

RAW264.7细胞的培养和传代：含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基加入80U/ml氨苄青霉素和100U/ml链霉素后通过0.22μm滤膜过滤除菌，于含5%CO2 的37℃恒温培养箱培养RAW264.7细胞，每隔24h至48h观察细胞状态并换液，必要时以1:2或1:3比例传代，以维持细胞的良好生长状态。

M1/M2亚型的刺激：干预前12h以105个/ml密度铺细胞于12孔板，以1ml完全培养基培养。待细胞完全贴壁且生长状态良好时加入不同浓度的刺激因子。根据不同文献的报道，将三种刺激因子的浓度均分为三个浓度梯度，并进行分组。IFN-γ分为25ng/ml，2.5ng/ml和1ng/ml三个浓度梯度；LPS 分为400ng/ml，200ng/ml和100ng/ml三个浓度梯度；IL-4分为100ng/ml，10ng/ml和1ng/ml三个浓度梯度。12h后观察细胞状态并吸去培养基，冰PBS洗三遍，收集细胞。

RNA的提取和逆转录：将收集的细胞按照RNA提取试剂盒说明书操作，提取的总RNA使用两步法进行逆转录，第一步，12μl体系加入1μl random primer，65℃，5min；第二步，再加入5×buffer 4μl，10nM dNTP 2μl，inhibitor enzyme1μl

中国分子心脏病学杂志 Volume 11 No.2 April 2011

和reverse enzyme 1μl，总体积为20μl，25℃，5min，45℃，60min，70℃,5min进行反应。逆转录完毕收集cDNA，直接进行Realtime PCR或储存于-20℃。

Realtime PCR：采用

SYBRⅡ嵌合荧光法，测量细胞各指标mRNA的表达（基因序列见表1）。反应条件为95℃温育l0s，95℃变性5s，61.5℃退火20 s，72℃延伸12 s，共45个循环，每个反应做3个复孔。内 …… 此处隐藏：4100字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……