DNA测序常见问题及其分析 - 图文(6)

通过调用工具（上图），进入Blast程序(说这个是Blast程序有点牵强，其实是同源性比较，其实质不就是Blast的嘛，哈哈)。

加上原序列文件A

之后，就直接按align all button啦

这个就是比对结果：

4、峰图头尾测序结果的不可靠性：

头尾的问题，很多测序公司都明确标出了头尾各80-100bp序列的不可靠性，这是测序起始信号与终止信号不稳定的体现，就如同一个跑步一样，发力起跑与力衰止跑之时，速度是不稳定的，无法用来衡量其跑步速度.....但俺见识过一家测序公司的测序结果，既使是头尾区，其结果也是可信的，但总体测序长度不够长，可能是用其它软件进行了掐头去尾之后移花接木的处理吧！

这里要强调一点的是，有时候测序公司给出的是反向测序结果，简单的align得不到匹配结果，这时，你千万不要急着骂测序公司，试试把测序结果reverse 或reverse complement一下再进行align，也许会有预期的结果(见过不少这样的朋友，其实仍然只能怪我们自己^_^) 5.干扰峰与结果判读

这个峰是作出来的，线条有点粗，将就说事。

第一个峰，重叠干扰。如果不判读为干扰峰，那就说明样品不纯，如果是基因组DNA，就很好地说明了样品为杂合子，该位点可能存在SNP现象（T/G）。如果判读为干扰峰，我们只需认定样品此处碱基为T为行了。

第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G），如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。

所谓干扰，前提前件是主峰要清晰、连续，但峰图中莫名其妙多出一条类似或接近于主峰清晰程度的峰线，但这种峰线往往是不平滑、不连续的，这是干扰峰判读的重点！

6、SNP的判读

做SNP的人不少，AFLP仍然是一种经济、适用的方法之一。AFLP的结果多需要用测序来进行验证，但似乎以测序来验证结果的人并不多，或者说验证一二个样本就完了，其实这样并不科学，还是多验证几个吧，证据多了，没人会说我们少了，但证据少了，我们自己说话都没底气，何苦自己给自己添乱呢？

前面说了干扰峰的判读，其特征是峰线不平滑、不连续，而SNP峰图跟主峰图一样，是连续的平滑峰线，且不存在错位！

见下图：

6、双峰、杂峰与乱峰、高GC片段测序：

双峰，图形上接近于SNP峰形，但碱基无法正确判读，通常以一连串N代表，仅有个别位置能正确判读出碱基。对于出现双峰的情况，坚决不付费，理由如下：

如果是PCR产物，测序前要对PCR产物纯化，我们一般都是让测序公司纯化，此时都指明了产物大小，此时如果出现双峰，是测序公司的责任，要么是它没纯化好，要么是它测序前进行的单链扩增质量不过关，而后者的可能性最大，因此，一旦出现双峰，公司应该及时终止实验（除非你说明要的就是双峰）并告之客户。

如果测序样品是质粒，抛开我们自己质粒抽提不纯的原因不管，测序过程出现双峰，公司同样应该终止实验。

公司不终止实验而让我们交纳由他们懒惰导致的材料消耗而收我们的费用，我们理应不给费用......

关于杂峰与乱峰,这个没太多说法，看着不顺眼的dd，说它是杂峰就是杂峰说它是乱峰就是乱峰，反正就是主峰不清晰，测序之序列结果不明确或不肯定，结果没法用。见识过杂峰仍要收费的角儿！希望下次你们不要碰上！

而对于GC高片段测序，一般测序公司有明确指出，测序结果低于300bp不收费，但俺见过测了100多bp也要收费的，俺也见过能测出500bp长高GC含量片段的，下次撞到了，据理立争！

7.测序引物找寻与目的片段确认

有时候，测序结果与预期目的序列毫不相干，是测序公司的错误还是我们自己样品的错误呢？那就从测序结果中查找测序引物吧，如果连测序引物都找不到，我们当然把责任归结于测序公司，如果找到了测序引物尤其是拿自己合成的引物来进行测序的引物，兄弟们，还是乖乖掏钱并立马重作实验吧......

8.测序中常见的怪异：

（1）寄给公司的细菌提不出质粒：这种现象不多但一个月也能撞上那么一次啦！公司用的是批量化操作，以许就那么霉，轮到俺这儿加样枪或其它什么出了点问题没挨到俺的细菌，三天后要求公司重抽吧，一般都能抽出来。

（2）测序没信号：就俺目前的经验而言，与公司技术水平、操作流程有关，有点和第（3）点类似，但要和第（4）点严格区分。

(3) 能测出头（尾）却测不出尾（头）：这种现象不少一个月至少撞上一次。好在自己还没遇到个N个公司都测不通的样品，这个公司不行，总有一个公司行！A公司测不来B公司却能测出来，能说明什么？反正不是我们样品的错。没经验的时候，把样品送到另外一个公司重测，现在不了，把样品送到其他公司后只测没测出来的那一端，两方面的结果一拼，同样可以确定测序结果。

(4)特殊样品的测序：如RNA干扰载体、病毒载体，这样的样品，测不出来不要怪公司，

只能找更好的公司去测。而对于有的样品，是需要自己特殊处理才能测出来的，记得有位朋友一个样本测了4个月才测出来，而另外一位朋友的样本，现在测出来没有也不清楚，至少有三个月了吧....