DNA测序常见问题及其分析 - 图文(5)

引物不纯造成移码现象，该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。 解决方法：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。

Q12.重复结构对测序有哪些影响？ 答：以下图为例：

重复结构将导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱。

解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。

Q13.什么是模板不单一？

答：以下图为例，下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。

解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。

对于PCR产物也同样有模板不单一的情况，如下图所示：

在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。 解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。

Q14. poly结构的测序结果是怎样的？ 答：以下图为例：

以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。

解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。

Q15.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ 答：以下图为例：

位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。

解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。

手把手教您看测序图

(From: http://www.qylj.cn/bbs/dispbbs.asp?boardID=14&ID=257&page=1 )

一般来说，我们只需把测序序列结果和原有的目的序列结果进行比对（Blast）就行了，如果序列百分之百吻合，或者所需要的突变点（片段）成功突变或插入片段成功插入，就OVER了。

关键是测序结果有时候模怜两可，需要我们自己来把握，或者说，为我们自己争取不付费的权利。

测序看图文件有吧？没有就下载这个：点击浏览该文件

里面有个补丁，打一下，就可以永久使用了。测序结果文件一般有两个，一个是序列文件，一个是图谱文件，图谱文件用上面的程序可以打开（*.abi.或 *.scf)。序列文件打不开？那您能随便装个什么DNAstar,DNAman或者俺最喜欢用的Genetool，或者装个edit（这玩意好啊，一般人没用过，呵呵）

1.安装好看图软件后，双击峰图文件就可以打开，没有序列文件？那下一个吧：点击浏览该文件

打开峰图文件，依据图形初步判定测序质量，这个图一般般，头峰杂度比较大，至少前50bp序列不可信。

HTUTU

UUTTH

2. 既然峰形不错由此初步判定测序结果可信，那就来比比测序结果与我们预期的有什么差异吧.....

当我们打开图形文件的时候，我们也可以输出测出来的序列，就是export啦，如下图，port后能得到文本形式的序列结果

不过俺一般习惯了用ultra-edit，直接双击测序公司提供的序列文件，它是这样显示的：

我说，您还是别用了，俺当初是用ultra-edit处理一些其它数据（当然是word/notebook等无法胜任的数据）时，发现它还可以打开*.seq文件，于是就一直用过来了

3.关于序列比对，没有太多好说的吧。假设原有序列为A文件，测序结果为B文件，例如，在DNA工具软件genetool中打开B，