DNA测序常见问题及其分析 - 图文(3)

下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰（插入后双峰），即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。

解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。

(2) PCR产物不纯，如下图所示：

在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。 注：PCR产物测序都是以A高峰终止。

解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。

Q-6.Poly结构的测序结果是怎样的？ A-6.以下图为例：

以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断。

解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。如果是较长的PloyG/C，建议客户使用3.0试剂盒进行测序。

Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ A-7.以下图为例：

位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。

解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。

A-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的？

A-8. (1) 产物中含有小片段PCR产物；(2) 引物有两个结合位点，其中一个结果中断

解决方法：换引物反向测序。

Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的？

A-9.原因和解决方法同回文结构及插入后双峰。