油菜素甾醇类物质的生理作用及信号传导11(6)

若干证据都证明，BIN2通过磷酸化BZR1和BZR2来负调控BR信号途径。首先，bzr1-1D和bes1-D突变体都充分抑制bin2-1突变体表型，这就支持了在BR通路中BZR1和BZR2是BIN2的下游因子的说法。其次，在酵母和在体外，BIN2都与BZR1,BZR2直接互作。第三，在体外BIN2能对BZR1和BZR2进行高效的磷酸化，BZR1和BZR2的这个转变这与BR处理后的转变相反。第四，在bin2-1突变体中，BZR1和BZR2的磷酸化以及累积水平受到抑制。另外，用化学抑制剂，如LiCl和bikinin对BIN2进行抑制，会引起BZR1和BZR2的积累。BZR1、BZR2和水稻的同源蛋白OsBZR1中有25个公认保守位点能被GSK3磷酸化，并且这些磷酸化位点似乎对转录因子有着不同的调控机制。

BIN2磷酸化对于BZR1和BZR2的功能有多重抑制作用。首先，被磷酸化的BZR1进入26S蛋白酶体介导的降解过程，因为用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，磷酸化的BZR1水平升高，而未磷酸化水平不变。但是现有数据对于BR处理能否引起BZR2水平的升高存在自我矛盾，在bri1和bin2-1突变体中BZR2水平均显著收抑制。其次，BZR1和BZR2的磷酸化抑制他们与DNA的结合活性。在体外BIN2-磷酸化BZR1复合体和BIN2-磷酸化BZR2都不能与从CPD或SAUR-AC1启动子得到的DNA片段结合，在BIN2存在情况下，酵母中的BZR2

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的转录活性也受到抑制，第三S173的磷酸化能与14-3-3结合，它们的结合抑制了BZR1和BZR2的细胞核定位。

对于BR能否诱导BZR1和BZR2的细胞核定位尚有争议。这个差异可能反应了在不同种类细胞或不同生长条件下的细胞的不同反应。例如，BR处理能快速提高刚出芽幼苗下胚轴中细胞核与细胞质的BZR1比例，但是在成熟幼苗中，这个反应就没有那么明显。亚细胞结构分离试验发现了磷酸化的BZR1能结合到质膜上，这说明磷酸化的BZR1能存在于细胞质中。另外，在拟南芥和水稻中的研究均证实了14-3-3蛋白在磷酸化的BZR因子的细胞质定位过程中的重要作用。

酵母双杂交方法发现，拟南芥中14个14-3-3蛋白中的5个与BZR1互作，水稻中8个14-3-3蛋白均与OsBZR1互作。14-3-3是能与磷酸化的堕胎结合的蛋白质，并且在所有真核生物中高度保守。他们参与多种信号通路中，调控酵母和哺乳动物内的多种进程。在植物中，14-3-3蛋白调控多种新陈代谢相关的酶，离子通道和激素反应如ABA和赤霉素。14-3-3s与目标蛋白的特殊序列结合，这个过程依赖于目标蛋白的磷酸化。它能特异性识别两种序列：模式一，RXXpSXP，模式二，RXXXpSXP（X=任意氨基酸，R=精氨酸，pS=磷酸化的丝氨酸，P=脯氨酸）。BZR1,BZR2和OsBZR1都包含一个保守的14-3-3结合模体（BZR1的169-175氨基酸序列：RISNSCP），其中BZR1所必须磷酸化的的S173在体外能被BIN2磷酸化。BZR1的S173A突变和OsBZR1的S156A突变完全破坏了它们与14-3-3在体内和体外的结合。BZR1-S173A和OsBZR1-S156A在转基因拟南芥中的表达引起组成性BR反应表现型，与bzr1-1D突变体类似，这说明与14-3-3的结合抑制了BZR1的功能这些突变蛋白在植物中似乎有正常的与DNA的结合功能，并且稳定性升高，但是它在细胞核的积累水平升高，细胞质内的水平却受到抑制。另外，用14-3-3的抑制剂AICAR处理后，细胞核内的BZR1-YFP水平同样升高，并且使受BZR1基因下调的CPD和DWF4基因的表达受到抑制。另外一个用原生质体系统研究的的实验同样证明BIN2介导的磷酸化能调节BZR1的细胞核-质之间的运输、14-3-3的结合区域和调控所需的其他磷酸化位点。总起来说，这些研究都证明了BZR因子在细胞质中定位这一过程依赖于磷酸化，且由14-3-3介导，同时在BR信号通路中起着重要作用。14-3-3蛋白可能通过促进BZR1的核输出和细胞质的包容性来增加它在细胞质中的定位。

拟南芥基因组中含有10个GSK3-like激酶，同样命名为AtSKs（Arabidopsis thaliana Shaggy-like Kinases），它们可分为四类。进来的研究证明其中属于第Ⅱ类得3个（AtSK21, AtSK22,AtSK23/BIN2）在BR信号中广泛发挥作用。它们的3重功能缺失型突变体表现出叶柄伸长，抗BRZ的表型。但是相当多的磷酸化状态的BZR2仍然存在于三重突变体中，表明可能还有其他AtSKs参与BR通路。实际上，AtSKs家族的全部9个成员的酵母双杂交实验证明，所有属于Ⅰ类和Ⅱ类的6个AtSKs均能与BZR1结合。对于家族Ⅰ成员之一的AtSD12深入研究证明，它在体内能与BZR1互作，在体外能磷酸化BZR1，在BR处理后失活。所以，至少有6个AtSKs在BR信号通路中发挥负调控作用。

除了BZR1和BZR2，BIN2还能磷酸化ARF2转录因子。ARF2是一个转录抑制子，对BR和生长素反应起负调控作用，机制可能是竞争抑制功能为促进受生长素诱导基因的表达的促进子（activator）与DNA的结合。功能缺失型突变体arf2对BR抑制剂BRZ的敏感性下降，说明ARF2在BR介导的生长过程中式一个负调控因子。在体外，BIN2能降低ARF2的转录抑制活性并且抑制它DNA结合部位的活性。有人提出假设BIN2通过抑制ARF2的活性来促进BR和生长

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素水平。但是BIN2作为一个BR通路的负调控因子，其活性受到BR的抑制，这就导致了BR的存在激活了ARF2。这似乎与ARF2的在下胚轴伸长过程中的负调控功能相矛盾，但与ARF2在促进雄蕊伸长和衰老过程相符。ARF2对BR

信号通路的调节机制和ARF2在BR反应中的功能有待于进一步的深入研究。

BSU1介导的Tyr去磷酸化和蛋白酶体介导的蛋白降解调控BIN2 人们确信BR通过抑制BIN2来诱导BZR转录因子的去磷酸化，但是尚不清楚BIN2活性是怎样被上游信号抑制的。在动物系统中，GSK3β在Wnt信号通路中的作用于BIN2在BR信号通路中的作用相似。GSK3β磷酸化β-catenin，进而促进其降解和细胞质中保留。这与BIN2与BZR1/2的调节类似。在哺乳动物中，GSK3β的行为受到它N端结构域的磷酸化、蛋白复合体的形成和其底物的磷酸化调节。但是这个机制并不适用于BIN2对于BR信号通路的调节。BZR1/2的一个由12个氨基酸构成的结合模体形成与BIN2的结合口袋，但是目前尚不清楚BR是否调节BIN2与BZR1/2的结合。同时Peng及其同事曾经报导BR诱导BIN2的快速降解，这个过程能被26S蛋白酶体抑制剂MG132所阻断。有趣的是，bin2-1突变体蛋白能在细胞内积累而在BR处理时不被降解，这为蛋白酶体在BR信号通路中BIN2的降解过程中发挥重要功能提供了遗传学依据。但是最初引发BIN2降解的机制尚未发现。

最近,Kim及其同事通过免疫印迹和双向电泳检测到BR诱导的BIN2降解过程。结果表明BIN2的降解可能需要蛋白磷酸酶的参与。最终发现这个磷酸酶即是BSU1（bri1 SUPPRESSOR 1），它当初被认为是介导BZR2的磷酸化。

BSU1是通过激活标记筛选bri1-5基因的等位基因发现的。BSU1包含一个N端的Kelch重复结构域和一个C短与磷酸酶1(PP1)同源的磷酸酶结构域。BSU1的过表达抑制bri1突变而且引起BZR2的磷酸化积累。BSU1同源蛋白的RNAi抑制引起弱的矮小表型。通过T-DNA敲除bsu1、bsl1和RNAi抑制BSL2和BSL3的方法构建的BSU1家族的4重功能缺失型突变引起极度的矮小表型，与bri1无义突变体类似，进一步证实了BSU1在BR信号通路中的正调控作用。

当BZR1或BZR2，BIN2,BSU1在体外混合时，BZR1或BZR2的磷酸化被BSU1抑制。但是BSU1的活性在体外更温和，推测在体内BSU1可能通过去磷酸化BZR1和BZR2来激活BR应答，但是需要翻译后修饰以及合作蛋白。但是,Kim及其同事最近发现，如果在加入BSU1之前除掉BIN2，重组BSU1或免疫纯化的植物BSU1并不能使被BIN2磷酸化的BZR1去磷酸化。只有当BIN2与BSU1同时存在时，BZR1或BZR2的磷 …… 此处隐藏：4648字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……