油菜素甾醇类物质的生理作用及信号传导11(4)

与BRI1磷酸化BAK1的激发环不同，BAK1主要磷酸化BRI1的JM区和CT尾巴。已经鉴定出BAK1转磷酸化BRI1的位点是JM区的3个残基（S838,T846,S858）和CT尾巴的2个残基（S1166,T1180）。此外，JM和CT的模拟磷酸化突变体的BRI1激酶活性增强；且JM区Ser/Thr替换为Ala后的bri1突变体在抑制bri1-5的短下胚轴表型缺陷上，比野生型BRI1更弱。这些结果就支持BAK1通过磷酸化JM和CT结构域来激活BRI1的假说综合起来，这些结果也就支持了一个BR激活BRI1-BAK1受体激酶的顺序磷酸化模型：BR结合诱导BRI1激酶的基底水平激活，然后BRI1与BAK1结合并磷酸化BAK1的激发环从而激活BAK1；激活的BAK1磷酸化BRI1的JM和CT而完全激活BRI1的激酶活性，通过增强BRI1磷酸化下游底物的能力实现其信号功能。

虽然磷酸化大多数位点都能激活激酶活性，但突变研究也找到了一些磷酸化能抑制激酶活性的位点。BRI1的T872A突变能增强激酶活性十几倍：其Vmax增加且Km减小。这说明T872的磷酸化具有负调控激酶活性的作用，不过也有可能是因为将这个Thr替换为Ala后，蛋白构象改变成了更有活性的状态。另外，BAK1的S286D突变在体外和体内实验中能使BAK1失活，但S286A却没有什么作用。在体外检测到S286是作为BAK1的自磷酸化位点。目前仍不清楚的是，BAK1的S286在体内的自磷酸化是一种脱敏机制，还是一种其他激酶调控BAK1活性的机制。

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一些磷酸化位点除了影响激酶活性，似乎也能介导特异性的信号输出。BRI1中JM区的Y831F突变对激酶活性没有明显影响，但表达Y831F突变的BRI1却能拯救bri1-5的生长表型缺陷，导致叶片更大、开花提前。这就意味着Y831的磷酸化可能对叶片发育和调控开花具有信号输出功能。此外，包含激发环上T450A突变的BAK1表达也能拯救bak1 bkk1双突变的细胞死亡和矮化表型缺陷，但不能拯救其鞭毛蛋白不敏感表型（91）。以上结果说明，个别磷酸化位点可能影响特异性的信号输出。

BRI1和BKI1的内吞 在哺乳动物和酵母中，内吞是将激活的受体从质膜传递到下游靶标、将受体从细胞表面清除以终止信号和使系统脱敏的普遍机制。最早研究人员在豌豆原生质体中观察到了BRI1和BAK1的内吞，且在原生质体中共表达BRI1和BAK1能加速内吞。最近，在拟南芥根细胞核内体中观察到了不依赖于BR处理的BRI1-GFP。一种阻止从初级核内体向次级成熟核内体的抑制剂Brefeldin A（BFA）能诱导BRI1-GFP在核内体小泡中的积累。有趣的是，BFA处理能激活BR信号，引起BZR2/BES1的去磷酸化和抑制DWF4的表达。相反，一种影响PM/核内体间运输的化学物质Endosidin 1能使BRI1-GFP在大的胞内体（large intracellular bodies）中积累，并有与bri1相似的矮化表型。BRI1的内吞似乎不受BR调控，但在原生质体中过表达BAK1能使其增强。

SERK1也是向胞内运输的，其内运与激酶相关的蛋白磷酸酶相关（KAPP）。KAPP具有一个磷酸化肽结合结构域（FHA），并依赖于激酶活性而于SERK1互作。共表达KAPP能增强SERK1的内运。尽管KAPP和SERK1都定位于细胞膜，但FRET检测发现，其生理互作只发生于胞内小泡（vesicles）中。这样，就有KAPP控制SERK1 内运的假说。KAPP也能依赖于磷酸化状态而与BRI1和BAK1互作，其不能与激酶活性丧失的mBRI1（K911E）和mBAK1（T546A）互作。kapp bri1-5双突变对BL的敏感性比bri1-5单突变更强，这预示KAPP可能是一个BR信号途径的负调控原件。KAPP究竟是通过去磷酸化受体激酶抑制BR信号，还是通过促进内吞而抑制BR信号的尚需进一步研究。

虽然这些研究说明了BRI1的正确定位对于其信号功能的重要性，但BRI1内吞的功能尚未知晓。基于BFA敏感的核内体BRI1对信号的正作用，有人提出内吞对与胞内蛋白互作提供了额外的表面空间和可接近性，或者是小泡包围并捕获受体-配体复合物以维持BR的信号。在根中，后一种假说或许更加重要，因为水能洗脱掉胞外的信号分子。在拟南芥中，BRI1定位于大多数细胞的质膜上，而核内体 BRI1只是在根细胞中观测到。另一方面，我们仍不知道BRI1如何从细胞表面去除，比如说在停止生长的成熟组织中。我们也不知道BRI1的内运是否像动物系统的一些受体一样，是参与受体降解的一种方式。

通过BKI1调控

BRI1/BAK1受体的活性也受其他互作蛋白的调控。除了BAK1，几个其他的新BRI1互作蛋白也通过酵母双杂交的方法鉴定出来了。其中一个即是BKI1，它能够负调控BRI1的活性。RNAi减少BKI1量能增强下胚轴的伸长，而过表达BKI1导致弱的矮化表型。此外，BKI1过表达能减少BR处理诱导的BZR2/BES1去磷酸化，也能改变BR调控的基因表达水平，这说明BKI1是BR信号的负调控原件。没有BR的时候，BKI1定位于细胞膜，但经BR处理后，BKI1迅速从

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膜上解离而到细胞质中。这些现象说明BKI1在细胞膜上与BRI1相互作用，使BRI1处于失活状态。BKI1抑制BRI1的部分原因也是阻止BRI1与BAK1的互作，因为在体外实验中，当与BKI1共培养后，BRI1与BAK1的互作减弱。一旦BR激活BRI1的激酶活性，BKI1即被BRI1磷酸化，并迅速与BRI1解离，使BAK1能与BRI1结合并完全激活BRI1。为了支持这个假说，人工在BKI1的N末端加上豆蔻酰化位点而强制使BKI1定位于质膜上，能增强BKI1过表达植物的矮化表型。这些结果说明，BKI1是当BR浓度低的时候使BRI1处于基底水平的另一种控制方式。

受体激酶的信号输出

BRI1-BAK1受体复合物的信号输出应该由这些激酶的胞内底物介导。出了BAK1和BKI1，还有一些其他的BRI1互作蛋白被鉴定出来，并且，至少咋体外实验中能被BRI1磷酸化。这些蛋白包括位于细胞膜上的TTL蛋白（TRANSTHYRETIN LIKE）、TGFβ受体互作蛋白TRIP-1的同源蛋白、BSKs（BRI1 Signaling Kinases）。

TTL在酵母中能与BRI1互作，在体外实验中能被BRI1磷酸化。过表达TTL能引起与bri1弱突变体相似的矮化表型，ttl敲出突变体显示出更强的BR敏感性和生长表型，这说明TTL通过与BRI1激酶互作而负调控BR信号。TTL与激活的BRI1的结合比与激酶失活的BRI1更强。这与BKI1恰好相反，因为BKI1与失活状态BRI1的结合更强。基于TTL定位于质膜上，有人提出TTL可能直接介导BR调控的控制细胞伸长的细胞膜的活性。目前还不知道TTL与BRI1的互作是否影响对BR相应的下游基因的表达。

TRIP-1与哺乳动物TGFβ受体互作蛋白序列相似。TGFβ受体互作蛋白在TGFβ信号途径中起重要作用，并且也是真核生物翻译起始因子eIF3的一个必需亚基。TRIP-1在体内实验和体外实验中，均能与BRI1互作；体内实验中，其至少有3个残基（T14，T89，T197或S198）能被BRI1磷酸化，暗示其为胞质内的BRI1激酶底物。有人提出TRIP-1可能在BR介导的翻译调控中起作用，然而还缺乏BR直接调控蛋白翻译的证据。最近，定量蛋白组学研究鉴定出了大量受BR调控的蛋白，但除了在翻译后磷酸化调控的BR信号原件以外，还没发现其他蛋白的蛋白水平和编码RNA水平的变化。

通过二维差异凝胶电泳，对总蛋白的蛋白组学研究鉴定出了BR信号途径后期的响应原件蛋白，但进行磷酸化蛋白分析或质膜部分分析，鉴定出了介导早期BR信号转导的响应蛋白。这包括BAK1和定位于质膜且只在BR处理后磷酸化的BR信号激酶BSK（BSK1、BSK2）（84）。BSKs属于含12个成员的RLCK XII亚家族，它们都包含有一个N末端激酶结构域和一个C末端tetratricopeptide基序。在拟南芥中，RLKs是一个拥有超过610个成员的大家族，其中25%是没有胞外域或跨膜区的RLCK（80）。在体外实验中，BSK1能被BRI1磷酸化，而不被BAK1磷酸化，且 …… 此处隐藏：4175字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……