油菜素甾醇类物质的生理作用及信号传导11(3)

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分析大肠杆菌表达并纯化的重组胞内结构域实现的，而体内磷酸化位点鉴定是通过分析免疫共沉淀的转基因拟南芥的表位标记BRI1或BAK1而实现的。这些研究明确鉴定出了11个BRI1中的磷酸化位点（6个是体内磷酸化位点，5个只在体外磷酸化）。质谱数据也说明存在不属于特定氨基酸残基的其他磷酸化位点，包括存在于第VII和第VIII结构域之间激发环上的至少3个位点。此外，磷酸肽作图（phosphopeptide mapping）之后进行的定点突变证明其他位点存在磷酸化（S1162）。尽管最初的质谱数据只鉴定出了Ser/Thr残基的磷酸化，最近的一项采用磷酸肽特异性抗体和质谱分析的研究为BRI1的Tyr残基在体内和体外都能磷酸化给出了令人信服的证据，这暗示BRI1是一个双重特异性激酶。

许多鉴定出的或推测出的BRI1磷酸化位点的功能已经通过定点突变后的体外激酶实验和bri1表型挽救实验得到了研究。这些研究证明BRI1激发环的磷酸化对于激酶活性具有及其重要的作用。体外实验中，S1044/T1045、T1049、Y1052、Y1057突变的BRI1几乎完全丧失激酶活性，并且不能挽救bri1-5的表型。两个激发环外的Tyr位点突变（Y956和Y1072）也失去了激酶活性，尽管在体内还没有检测到Y1072的磷酸化。

BRI1的JM区和C末端结构域磷酸化的重要作用也被证明了。去除JM区后，BRI1不能发挥信号作用和拯救bri1-5突变体表型，并且没有影响BRI1在质膜上的定位。通过质谱分析，鉴定出了JM区的7个磷酸化位点，它们在体内和体外实验中能自我磷酸化。其中，四个磷酸化位点的模拟磷酸化替代（S838D、T842D、T846D和S858D）在没有BAK1的情况下增强了BRI1自身的磷酸化，说明JM区的磷酸化激活了BRI1。然而，JM区调制BRI1活性的激活机制目前仍不清楚。

与JM相反，在体外实验和体内实验中，去除CT区域的BRI1能增加BRI1的激酶活性，且比野生型BRI1更加有效促进地bri1-5和det2突变体的下胚轴生长。CT尾巴的多个Ser/Thr位点都是磷酸化的，其中8个可能的位点中的4个（S-1162、S-1166、S-1168和T-1180）已经被实验证实。将CT的多个Ser/Thr残基替换成Asp后能显著增加BRI1不依赖于BAK1的激酶活性。此外，将CT尾巴包含模拟磷酸化突变位点的BRI1突变体能更加有效抑制det2的矮化表型缺陷。这些研究结果说明，BRI1的CT尾巴是其激酶结构域的自抑制区，磷酸化可以减轻抑制效应。BRI1的JM区和CT尾巴的功能说明，胞内域的非催化部分在特异性调节激酶的活性中起着重要作用。哺乳动物受体激酶胞内非激酶结构域不仅在自调节中起重要作用，也为底物创造结合位点，而这些作用是依赖于磷酸化状况的。同样，BRI1的JM区和CT尾巴也可能参与调节激酶活性，并能为BRI1下游底物创造结合位点。

目前已经鉴定出了BAK1胞内域的9个磷酸化位点，其中5个（S290,T312,T446,T449, T455）在体内磷酸化，4个在体外（S286,T450,S604,S612）。和BRI1不同的是，BAK1的磷酸化主要发生在激发环（T446,T449,T450,T455）上，不过最近在体外也鉴定到了CT尾巴上的2个磷酸化位点（S604，S612）。BAK1激发环上对应于BRI1 T1049的T455残基的磷酸化在其功能发挥中是必需的，因为将T455突变为A以后，激酶活性丧失。尽管激发环上其他磷酸化位点的单突变对BAK1的活性没什么影响，但将所有3个Thr突变为Ala

（T446A/T449A/T450A）后激酶活性也会丧失，预示激发环的磷酸化对BAK1的激酶活性至关重要。

虽然分析体外自磷酸化位点和体内磷酸化位点已经阐明了其磷酸化状态能

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影响激酶活性和信号功能的重要氨基酸残基，但BR调控这些位点磷酸化过程的机制仍然不清楚。最近，有人提出BR诱导的BRI1和BAK1的结合是BRI1激酶第一步激活的结果，接下来BRI1和BAK1相互转磷酸化，进而激活这两个受体激酶。

BR诱导的BRI1和BAK1的结合依赖于BRI1的激酶活性而非BAK1，因为BR能增加野生型BRI1和激酶活性丧失BAK1的互作，但不能增加突变体BRI1和野生型BAK1的互作。尽管突变体BRI1仍然能与BAK1有基底水平的互作，但其不能由BR处理而增加。此外，BRI1过表达能增强BR诱导的BAK1磷酸化，但在bri1无义突变体中没有此效应。相反，在bak1 bkk1（serk3 serk4）双突变背景下，BR处理仍能诱导BRI1磷酸化，虽然和在野生型背景和BAK1过表达背景下的相比，其磷酸化水平要低一些。体外实验中，BAK1对BRI1的预磷酸化增加了BRI1对底物特异的磷酸化水平，暗示BRI1具有能被BAK1转磷酸化显著增强的基底水平磷酸化。此外，过表达BRI1能拯救bak1 bkk1双突变体的下胚轴伸长表型，而过表达BAK1却不能抑制bri1无义突变体的表型缺陷。然而，在bak1 bkk1双突变体内SERK1可能仍有功能，因为它也能与BRI1结合并对BR信号起作用。这样，为了了解BAK1及相关蛋白是否在BR诱导的BRI1激活中起着必要性的作用还是支持性作用，还需要研究bak1 bkk1 serk1无义三突变体。

BRI1和BAK1的相互激活由转磷酸化介导。通过以一个激酶失活蛋白作为另一个野生型蛋白的底物的体外激酶实验，已经鉴定出了转磷酸化的位点。质谱（MS）数据显示BRI1主要磷酸化BAK1的激酶结构域。有6个BAK1残基能被BRI1磷酸化（S290，T312，T446，T449，T450，T455），其中的4个Thr残基（T446，T449，T450，T455）位于激发环，对于BAK1的激酶活性和信号功能是必需的。将T455突变为Ala，或者将T446、T449、T450全部突变为Ala后，BAK1的活性均会丧失。所以，BAK1磷酸化这些残基后，可能就激活了BAK1。 …… 此处隐藏：886字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……