DNASTAR中文使用说明书(8)

按特征对引物分类 71 引物长度改变 72 在引物中引入突变 73 设计新引物 74

使用寡核苷酸订购表格 75 保存PrimerSelect文件 76

创建PrimerSelect文件

我们将以克隆载体pBR322为模板DNA序列。在这一节中，我们选择引物，用来扩增位于2013-2169位的H-strand Y effector。首先我们从打开模板序列开始。

l 从文件菜单选择New创建一个PrimerSelect文件。

l 从文件菜单，选择输入序列（Enter Sequence）。打开下面的对话框。

l 从“Demo Sequences”选中pbr322.seq（视窗口）的文件，或者PBR322（苹果计算机），单击Add添加序列到右面的窗口。然后点击Done打开序列。

定义引物特点和位置

下面我们开始确定引物的类型。

l 从条件菜单（CONDITIONS MENU），选择Primer Characteristics打开左面的对话框。这对话框可以用来设定各种参数诸如：引物长度、最大的3’pentamer稳定性和可接受的重叠。注意默

认的引物长度为17-24 bp，并且1或2 bp的二聚体和发卡样重叠示可以接受的。 l 不改变默认设定和单击Cancel退出。

l 从条件菜单，选择Primer Locations打开右边对话框。这个对话框允许我们根据给的序列的长度来限制引物的位置。

l 从下拉菜单的Restrict Locations中选择Upper and Lower Primer Ranges。当在全序列中设计编码区的PCR引物时，这是最好的选择。

l 在Upper Primer Locations右面的方框中输入1700和1950。在Lower Primer Locations右面的方框中输入2250和2500。

l 单击同意，会出现下面的窗口。成对的绿色和红色的三角形分别标记所设定的正向和反向引物的范围。

寻找引物对

现在我们已经指定什么种类的引物对是可接受的，剩下的工作就是让PrimerSelect为我们寻找理想的引物对。 l 从LOCATE MENU选择PCR Primer Pairs。打开一个二分窗口，上面窗口中显示计算机寻找到的28对理想引物对，引物对按照评分值依次排列。因为调色板工具中的Alternate Pairs被默认激

活（在窗口左面工具中），所以底部窗口显示的是上面窗口选定的引物对的替代引物对一览表。 l 通过拖动在窗口的右侧上的小环拉开建议窗口，可以查看PrimerSelect对选定引物的建议。

注意现在的“Best choice.”是PrimerSelect根据在最初的条件中设定的参数计算得到的。看下面的窗口，PrimerSelect列出了“Best choice”引物对的25替代选择。这些替代的引物对扩增

的区域和上面选定的引物一样，所不同的是他们的序列有些不一样。

l 选择调色板工具中的Alternate Products（左侧工具底部），下面窗口显示引物的位置和可能错配的位置，以及相应的产物长度。左面的那个单一的粗黑棒提示用我们“Best choice”引

物进行反应，会有大量产物被扩增出来。如果没有多个5’或者3’引物箭头也提示这一对引物没有错配点。 l 单击上面窗口里引物对，观察下面窗口里的产品棒变得越来越细表示预期的扩增物也越来越少。

注意有8个引物对有错误的配对点，用粉红色或淡绿色箭头指示出来。第13对和第22对正向引物有错配点（右边显示），就会用第二条产品棒的表示错误的产品大小。

查看引物的其他信息

PrimerSelect能预测引物形成self-dimers, pair-dimers and hairpins的可能性。 l 单击选定“Best choice”引物。

l 从报告菜单（REPORT MENU），选Amplification Summary，打开左面的窗口。显示用所选个引物做PCR扩增反应的报告。

l 选择Composition Summary，打开右面的窗口，描述扩增区和引物对的碱基组成。

l 从报告菜单，选择Self Dimers，Pair Dimers和／或Hairpins打开新窗口显示每种二级结构的预测结果。Self-Dimer形成窗口如右。

按照引物特点分类

PrimerSelect在自动将引物按照从好到坏的顺序分类以前，已经计算了引物的各个特点。Located Primers & Probes窗口是我们能够根据引物的不同特点，如引物位置、长度、溶解点或自由

能等，来对引物进行分类。这里让我们用溶解点来分类引物。

l 从报告菜单，选择Located Primers & Probes打开左面的窗口。窗口显示符合我们标准的引物的一览表。在没有特

别指定的情况下，引物按照位置排列。

l 从LOCATE MENU选择Sort Primers打开下边对话框。

l 保留对正向和反向引物的选定，去除对By Position的选定。选定By Tm Nearest方框，输入65。 l 单击同意，现在两个窗口里的引物按照融解温度离65oC最近的程度依次排列。

改变引物长度

PrimerSelect’s工作台允许你在引物中引入限制性酶切位点，突变，改变使用的密码子，核查引物二级结构，查找错配点。在这一节中，我们将用正向引物工作台来扩展我们的引物长度。 l 双击选定正向“Best choice”引物。

l 从编辑菜单，选择Work on Upper Primer打开下面的窗口。

l 确认Dimer，Hairpin和Priming Sites调色板工具（窗口左侧从顶端起的4-6）已经激活。

让我们仔细查看一下工作台。在窗口下边的第3排可以看见引物序列。序列两端的三角形“handles”允许你缩短或者延长序列。在窗口的左上角的标题告诉我们引物的长度是23核苷酸，溶解

温度为65.5度；而底部窗口的绿色棒显示引物在序列上的大概位置。下面的信息告诉我们没有大于2 bp的二聚体形成，并且引物只能形成一个并不理想的发卡样结构。拖动窗口左边的滚动条

之间的黑框调整上下窗口的比例。

l 拖动引物左上黑三角形直到长度延伸到33核苷酸。

现在引物的长度已经显示在窗口的标题中。引物的溶解温度也增加到78.6度，将难以进行PCR。看下面的窗口有二聚体和发卡形成，并标记（坏！）。由于长引物容易形成稳定的二聚体和发卡

样结构，所以我们设计的引物经常较短。

l 再一次拖三角直到引物最初的23核苷酸。窗口又和我们开始打开它的时候一样了。

引物中引入突变

PrimerSelect工作台可以很容易的在引物中引入突变。我们“Best choice”的正向引物序列只编码一个苯丙氨酸。在这一节中，我们把读框1的苯丙氨酸通过改变读框中的密码子转换成苏氨

酸。转换完成后我们将可以观察到我们变化的效果。

l 点击引物下面，读框1中绿色的苯丙氨酸，会出现一个小盒子（如右）。盒子中显示全部4种可能的苯丙氨酸密码子和词“Other.”标记的GCC是这个苯丙氨酸残基的密码子。

l 选择Other会自动跳出一个子菜单，其中显示所有的氨基酸及其代号，在“T-Threonine.”上点击一下，模板序列

上的碱基组成没有改变，但是引物序列和其编码的氨基酸（Thr-Ala）发生 了改变。

Thr显示为红色，表明它是从最初的引物序列上突变得到的。查看屏幕底部的左角，可以看到引物形成了一个稳定的二聚体。我们可以通过给我们的Thr残基做沉寂突变来删除这个不受欢迎的

二聚体。我们试着把苏氨酸的密码子改变为ACC。这个密码子与苯丙氨酸密码子（GCC）只有一个核苷酸不同。 l 单击红的Thr残基，从菜单中选ACC代替现在的ACT。

下面的窗口显示从G到A的单一的核苷酸变化去除了二聚体。另外，正向引物的融解点已经从65.5减少了到53.7。也许正向引物新的溶解温度可以与反向引物匹配，但是我们可以找到与之更相

匹配的反向 …… 此处隐藏：3325字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……