牛奶和乳制品中唾液酸的测定 - 图文(4)

低。不过，这些数字并不意味着处于结合糖状态（大部分样本中唾液酸的存在形式）的唾液酸就很稳定。因此，为了避免校正过度，这里我们不用在矫正曲线上补偿水解中的降解部分（假设结合状态的唾液酸比游离状态的唾液酸稳定）。 尽管用硫酸进行水解的结果和这些用甲酸进行水解的结果相似，同时还能减少水解的时间，但是用硫酸进行水解后在色谱图上会有一些微弱的干涉信号。因此最终为避免这些多余的信号，决定使用甲酸对样品进行水解。 <3>衍生条件的最优化：

一般，为了能简单直接的对不含生色团的碳水化合物进行检测，一般使用UV之类的液相色谱法。对碳水化合物较为有效和灵敏的分析方法是对其进行荧光标记。对唾液酸的检测，有以下几种衍生手段，包括过-O-苯酰化酌，用1,2-二胺-4,5-二甲氧基苯（DDB），4'-肼基-2-芪唑盐酸盐，邻苯二胺（OPD）或DMB进行标记。衍生化的最普遍方法就是使用DMB（一种与α-酮酸发生特异反应的化合物），这样能使唾液酸衍生出酞嗪酮。OPD也被认为是有效的衍生试剂，同时据现有的报道，使用它发生衍生反应所花费的时间比使用DMB短。虽然使用OPD进行水解的时间短，但是HPLC的对DMB的衍生物分离更优化，而用OPD进行衍生反应的唾液酸则不适合进行HPLC的分离。因此，虽然OPD在衍生反应方面有很多优点，并且可以在40min内完成反应，这种试剂却并没有继续研究下去。因此，我们选择DMB作为衍生试剂，同时对衍生反应的时间，温度，和与酸的耦合反应等方面进行优化。文献中（Table2），大部分DMB衍生的条件都相似，除了一些溶剂的浓度略有不同外，衍生反应都是在50?C到60?C的条件下进行的，通常反应的时间是2.5h左右。

注：除了中村和他的同事在100?C，很短的时间内进行唾液酸的衍生反应。不过，在他们发表的论文中，唾液酸并不是作为被分析物研究的（不是为了检测唾液酸的量），他们的目的是揭示各种衍生试剂的不同。

在对唾液酸进行的衍生反应中，Hara和他的同事通过唾液酸的一系列标准溶液和特定的反应条件研究了荧光反应强度的相对反应时间。他们发现在反应5h后，峰值依然在增加。Stanton和他的同事及Manzi和他的同事发现，如果将被标记的唾液酸置于4?CHPLC自动取样器的环境中储存，在分析时再进行注射，也会有相似的现象。Hara和他的同事发现若反应在很高的温度下进行，反应的速

度会变快。Fig.3中我们可以看到80?C下的反应状况，其中平行线（2.5 h, 50 ?C）是Hara和他的同事做的空白对照。对于Neu5Ac，反应在80?C，40-50min左右就能达到反应的最大值。不过，Neu5Gc有点不同，在研究时间内它并没有达到反应的最大值。因为Neu5Ac是牛奶（婴儿配方奶粉，成长奶粉）最丰富的唾液酸，所以通常对衍生反应的优化主要针对Neu5Ac。即使Hara和他的同事发现Neu5Ac在80?C下无法达到检测器的最大反应，但因为在这个温度下，衍生反应完成的最快，所以常使用这种条件。不过若要避免检出限的问题，则要在更低的温度下进行较长时间的反应。我们选择在80?C，50min用DMB做衍生反应试剂进行衍生反应（Hara和他的同事的方法）。我们使用的DMB是1年内在-20?C下储存于棕色离心管的200μlDMB（Reuter和Schauer的研究）。、

Fig.3：唾液酸的衍生反应

唾液酸的DMB衍生物的稳定性也在研究中。标准的Neu5Ac和Neu5Gc混合液照上述的方法进行衍生反应，在24h后注射141份它们的溶剂发现，尽管峰值不断地增加，但是最小值和最大值的相对标准偏差为0.5%时，它们之间相差2%。因此发生DMB衍生反应的唾液酸在4?C时相对来说较为稳定。同时一份试剂注射后，

其运动的时间为7min，因此我们可以在几小时内完成一系列被分析物的分析，而不用担心DMB衍生物发生变化。 <4>方法的正确性检测：

对色谱柱中Neu5Ac检测的线性范围是0.12-4.8ng，对Neu5Gc检测的线性范围是0.02-4.5ng。两者的校准曲线可以见Fig.4

Fig.4：一般方法校正曲线的线性范围

方法的准确性是由实验的重复性和中间重现性体现的（Fig.5）对Neu5Ac，除酸奶的重复性的相对标准偏差（RSD(r)）为7.22%外，其余RSD(r)小于2%，除粉末冲剂饮料的中间再现性的相对标准偏差RSD(iR)为3.58%和酸奶的RSD(iR)为6.79%外，其余RSD(iR)均小于3%。对Neu5Gc，除酸奶的RSD(r)为7.94%外，其余的RSD(r)在3.2%以下，除酸奶的RSD(iR)为6.45%和液体冲剂饮料的RSD(iR)为9.31%外，其余的RSD(iR)均在5.5%以下。唾液酸是由Neu5Ac和Neu5Gc的总量和表示。数据的统计分析发现Neu5Ac是所有的产品中唾液酸的主要成分（通常95%以上）。和其他的研究者的数据相比，我们的数据有很好的准确性：Hara和他的同事得到Neu5Ac标准物的RSD(r)值在3%-5%之间，Neu5Gc标准物的RSD(r)值在2%-5%，Stanton和他的同事分析从糖蛋白游离出的Neu5Ac的RSD(r)为5.1%。Martin和他的同事通过分析奶制品（婴儿配方奶粉）得到的唾液酸的正确性检测的数据显示，Neu5Ac的RSD(r)的值为2.7%-4.8%，RSD(iR)为4.4%（未检测Neu5Gc）。

很难有恰当的方法获得实验的准确性数据（回复值）。理论上，使用能与唾液酸结合的很好的材料做基准物质。可是，这样一种基准物质并不存在。USP提供了两种结合唾液酸的物质：Neu5Ac和Neu5Gc。我们已知其中游离唾液酸的含量并分别对这些物质在水解和未水解的状态下进行分析。未水解的情况下，我们能得到极好的回收率，其中Neu5Ac是95%，Neu5Gc是100%。充分有力的数据表明没有一个值与100%有显著地差异。相反，水解后，Neu5Ac的回收率下降到90%，Neu5Gc的回收率下降到94%。这些数据表明水解后的唾液酸回收率与100%有显著性差异。

通过同位素示踪法对从食物中回收到的唾液酸进行检测，我们共检测了三种水解后游离唾液酸的浓度水平（Table6-8）。通过USP提供的理论数据，我们发现回收率大体与100%有显著性的差异，Neu5Ac回收率的范围是87%-102%，Neu5Gc是90%-108%，两者总和的范围是87%-102%。和Martin和他的同事的回收率数据进行比较，Martin得到的婴儿配方奶粉（与成长奶粉相似）中Neu5Ac的回收率范围为98%-103%，与目前的方法得到的范围96%-101%相似。在以大豆为主要成分的饮品中，回收率也很相似，Martin和他的同事的得到的回收率为97%-99%，

目前的方法得到的回收率为95%-98%。在乳清蛋白浓缩物的样本（WPC）中，同位素示踪法显示其回收率很低。这可能主要是由于回收实验中的设计原因。WPC中的唾液酸的浓度很高（9210mg/kg）。因此，为了在检测器的检测范围内保留WPC处理后的样本和保持唾液酸的最终浓度水平，示踪同位素法的水平与天然唾液酸的浓度相比需要足够的低（天然唾液酸的20%，40%和60%被同位素标记）。而对另一种样品来说，当天然物的浓度越低，而示踪同位素法的标记程度越高，回收率就越好。

Table6：Neu5Ac的回收率

Table7：Neu5Gc的回收率