牛奶和乳制品中唾液酸的测定 - 图文(2)

行分析。对每种浓度范围，分别对8个均等间隔的浓度进行进样，每份样进三份。在色谱柱中，对Neu5Ac浓度的研究分别在0.02 -0.16 ng, 0.13- 0.29 ng, 0.22-1.01 ng, 0.61 - 4.89 ng, 和4.48-5.63 ng之间，对Neu5Gc的浓度研究则在0.004-0.031 ng, 0.02-0.18 ng, 0.11 -0.89 ng, 0.57-4.56 ng, 和 4.18-5.24 ng之间。线性的程度是由校准曲线图，响应因素和残样量共同决定的。

检测下限（LoD）是由每种被分析物在保留时间中测量到的基线噪声和三倍基线噪声高度时的被分析物浓度共同决定的。Neu5Ac在色谱柱中的检测下限为15.6pg。Neu5Gc在色谱柱中的检测下限为5.4pg。

为了对重复性和再现性进行测定，每个样本由三位不同的分析师在至少不连续的8天内对同一样本在同一实验室里通过6种不同的DMB试剂进行处理，4种不同批次的标准唾液酸溶液和3种不同的分析色谱柱进行分析。

我们对该方法的准确性检测是将每个被分析物的母体进行8种不同示踪同位素的标记，分别再对它们三种不同水平的浓度进行检测（示踪同位素的水平需要适应每种样本的母体且各值要处于线性范围内）。每种样本母体在重复的条件下对其各示踪同位素水平进行6次分析。

所有数据的分析是在充分有力的统计数据和内部统计程序Q-stat下进行的。 ②实验方案的选择： <1>色谱条件：

DMB标记的唾液酸一般是在混合物乙腈，乙醇和水做流动相的条件下在反相色谱柱中进行分离的。有时，酸或缓冲液对唾液酸的修饰会对唾液酸的分离进行调节。Table2中可以找到对几种流动相的总结。目前对分离条件的研究是基于Hara和他的同事的成果，即使用DMB对唾液酸（Neu5Gc和Neu5Ac）进行衍生。 Hara和他的同事共列出十一种利用乙腈/乙醇/水（9:7:84, v/v/v）做流动相的色谱柱（table3）。包括4种长度为150mm的色谱柱（颗粒大小3 - 5 μm，柱径2.1 - 4.6 mm），6种用于快速HPLC的色谱柱（4.6×50 mm)，颗粒大小为1.8 -3.5 μm和一种颗粒大小为3.5-μm的与苯基结合的固定相的色谱柱（4.6×50 mm)。在长的色谱柱中，Zorbax SB-C18与其他色谱柱相比分离效果最好，且峰形最好（拖尾因子：Neu5Gc：1.08，Neu5Ac ：1.04）。Sunfire C18与它相似，但拖尾

因子较高。在短的色谱柱中，Zorbax SB-C18和 Sunfire C18效果也是最好的。Sunfire C18对唾液酸的分析和高分辨率的测定能与理论值有很好的符合性。尽管Neu5Gc在 Zorbax SB-C18色谱柱中的拖尾因子稍低，但被分析物这两种色谱柱中的拖尾因子基本相似。综上，最优化的方案为选择Zorbax SB-C18做色谱柱。

Table3：对Neu5Gc和Neu5Ac的不同HPLC色谱柱的比较

我们对几种混合溶液在不同比例的乙腈，乙醇和水（也可用含水的缓冲液或稀酸代替）的混合物做流动相的条件下在Zorbax SB-C18中进行了检测。在使色谱柱适应流动相的前提下，虽然可以将两峰间的分辨率由1.61提高到2.87，但却同时会影响到峰的对称性。不过，随着流动相不断地优化，最近出现了一种新的，快速的色谱柱Zorbax SB-Aq。因为它有优良的对称性，且要比Sb类型的色谱柱有更优良的性质。同时，在所有的流动相下，SB-Aq均比SB有更好的峰形，尽管分辨率有所下降。因此最终选择以乙腈/乙醇/乙酸（25:75:0.05, v/v/v）为流动相，以Zorbax SB-Aq(4.6 * 50 mm, 3.5 μm)为色谱柱的色谱系统。它的选择是基于层析效能，配制流动相的难易度和与液相色谱-质谱联用的综合考虑下做出的。标准物和样本的色谱峰图见Fig.1.