牛奶和乳制品中唾液酸的测定 - 图文(3)

我们可以用酶或酸对唾液酸的复合物进行水解，从而使其从结合糖中释放。尽管酸水解便宜有效，但却很难在被分析物的释放和水解过程中达到很好的平衡。比如，有报道称在50 mM 硫酸或 100 mM 盐酸(50 min, 80 C)的水解下，唾液酸会有10%的损失。相似的，在25 mM盐酸, 25 mM 三氟乙酸(TFA), 或2 M乙酸 (2 h,80 C)的水解下，会造成唾液酸20%的损失。根据Lamari，Karamanos 和

Fig.1：Neu5Gc和Neu5Ac在不同样品中的色谱图。G：Neu5Gc，A:Neu5Ac

Schauer的研究，甲酸造成的损失最小，但可能不能彻底完成水解。为了让唾液酸更有效地被释放和最大限度的减小损失，因此就有很多唾液酸在不同水解条件下的报道（table2）。虽然酶水解在充分的反应后也不大可能降解唾液酸，但是因为在酶的水解后仍有很多未被水解的残余物，因此很难达到唾液酸的定量测定。所以，就有很多酸水解和酶水解的水解条件方案，对唾液酸的结合物进行水解。

成长奶粉（Nestlé Excella Gold）作为一种模式样本母体，它的酸水解有乙酸水解（Hara和他的同事），硫酸氢钠水解（Anumula）和甲酸(0.5 M)三种水解方式，最终得到Neu5Ac和 Neu5Gc两种水解产物。这两种水解方式都是在80?C的条件下进行的（Fig.2）。同时，样本也可以在37?C，由两家不同公司提供的唾液酸酶（EC 3.2.1.18）的作用下进行水解（Fig.2）。其中的一项最重要发现也许就是Neu5Ac和 Neu5Gc所需的水解条件不同。比如说当使用硫酸氢钠进行水解时，Neu5Gc在30min后达到水解的最大值，而Neu5Ac在1.5h后才可以达到水解的最大值。另一方面，在甲酸或乙酸的水解条件下，Neu5Ac到达水解的最大值（分别2h和3h）要比Neu5Gc快，Neu5Gc在4h后仍达不到水解的最大值。

Fig.2:不同水解条件下婴儿配方奶粉的检测

尽管乙酸（2M）经常在文献中被提到用于水解反应（table2），但我们在研究中发现0.5M甲酸进行水解，样品有更高的回收率（Fig.2）。唾液酸酶水解释放的Neu5Ac与乙酸作用释放的量相似，不过，酶的价格较贵，并且难以掌握。同时，若用唾液酸酶，Neu5Gc的吸收峰会扭曲且不易被整合。目前干涉的来源和对它的判定还未搞清和解决，很可能是由于未知曲线造成的影响。Fig.2是酶的水解线，希望能对其做出适当的说明。

唾液乳糖也可由乙酸，甲酸和唾液酸酶进行水解。这样，通过唾液乳糖的水解量就可以很好的计算唾液酸的理论当量，因而可以对唾液酸的回收进行有效地估计。当用甲酸（0.5M，80?C）水解成长奶粉，1h后唾液酸的水解就达到了最大回收率，为88.2%，2h后则能达到释放的最大值。用甲酸水解2h后，回收率会稍有下降，为86.8%。当用乙酸进行水解（1.8 M, 3 h, 80 ?C），其回收率为85.5%。当使用唾液酸酶，1h后回收率就能达到88.0%，并且在4h内回收率都能维持稳定（更长的时间未进行研究）。当使用0.5M的甲酸去水解唾液乳糖，Neu5Ac的回收率可以和用乙酸和唾液酸酶进行水解相比。当水解成长奶粉时，与其他酸水解相比，使Neu5Gc和Neu5Ac的释放的最有效地方式是使用甲酸（0.5 M, 2 h, 80 ?C）水解，而同时其释放的唾液酸的量与酶水解释放的量相当。

使用50mM硫酸（1 h, 80 ?C）进行水解是另一种常用的水解唾液酸复合物的方法。这种水解方法在应用于成长奶粉样品和胎球蛋白时可以和用甲酸（2h，80?C）水解相比。Table4比较了两者的值。不过，在研究两种DMB标准唾液酸衍生物溶液的RF值时，使用硫酸的值要比使用甲酸的值低15%-20%，同时当使用硫酸时，会发现在Neu5Ac的附近有伴随峰。

Table4：唾液酸水解的比较

我们在甲酸（0.5 M, 2 h, 80 ?C）和硫酸（50 mM,1 h, 80 ?C）的水解条件下分别对游离唾液酸的降解进行了研究。同没有加热的溶液相比，在峰值区域两者分别损失6%，4%。这里的唾液酸降解的量要比以前报道过方法的降解的量略