动物生物化学实验教程正式(6)

实验九 血清IgG 的分离与制备

免疫球蛋白是人类及动物受到抗原刺激后在机体内产生的能与抗原特异性结合的一类球蛋白，又称为抗体。根据其免疫性质的不同，分为IgG、IgA、IgE、IgM和IgD等五类。其中IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，在血清中的含量较高。

盐析法是对蛋白质初级分离的重要方法之一。盐析法就是通过控制中性盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步沉淀出来，达到分离蛋白质的目的。本实验采用饱和硫酸铵溶液分级沉淀方法，初步分离血清中的IgG。

一、实验目的

1．学习盐析方法分级沉淀分离蛋白质的原理和方法。 2．掌握从血清分离IgG的原理和操作方法。

二、实验原理

蛋白质是亲水胶体，带有一些正电荷和负电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水化膜，这些因素维持蛋白质水溶液的溶胶状态。当加入少量盐时，增大了蛋白质在水中的溶解度，出现盐溶现象。但当盐浓度增加到一定浓度时，蛋白质发生沉淀，出现盐析现象。（蛋白质溶解度，取决于其水合度）

- +-（氨基酸有酸性氨基酸和碱性氨基酸，-COO和 –NH3，所以带正电、负电。-COO与H2O的H+形成+2-氢键，–NH3与H2O的O形成氢键，故而形成水化膜。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。增大盐浓度，一方面中和蛋白表面极性基团，一方面盐粒子竞争结合水分子而破坏水化膜）

IgG不溶于35 %饱和度的硫酸铵溶液，据此，首先在50 %饱和度的硫酸铵条件下沉淀球蛋白，溶解后，再采用35 %饱和度的硫酸铵沉淀IgG，达到逐步出去杂蛋白和浓缩IgG的目的。

三、实验操作步骤

1．在1支10 mL离心管中加入2 mL血清和2 mL 0.01 mol/L（pH7.0）磷酸盐缓冲液，混匀。取4 mL饱和硫酸铵溶液，用胶头滴管加入血清溶液中，边滴加边搅拌，使溶液的最终饱和度为50 %，然后4 ℃静置15 min，充分盐析。

2．3000 r/min离心10 min，沉淀为球蛋白。弃去上清液。

3．将沉淀溶于2 mL 0.01mol/L（pH7.0）磷酸盐缓冲液中，滴加饱和硫酸铵溶液1 mL，使溶液的饱和度达35%，4℃静置20 min，充分盐析。

4．3000 r/min离心15 min，沉淀即为IgG的粗品。

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四、实验试剂

1．饱和硫酸铵溶液：称取(NH4)2SO4 800 g，加蒸馏水1000 mL，不断搅拌下加热至50~60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100 %饱和度。使用时用浓NH4OH调至pH7.0。

2．0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液61.0 mL， 0.2 mol/L NaH2PO4溶液39.0 mL，混合，用酸度计检查pH应为7.0。取该混合液50 mL，加入7.5 g NaCl，用蒸馏水加至1000 mL。

五、实验器材

离心管，电冰箱，离心机，胶头滴管，刻度吸管

六、实验过程中应注意的问题：

用滴管边加边搅拌，是为防止饱和硫酸铵一次性加入或搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的蛋白质；搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。

七、实验考察点

盐析法分级沉淀蛋白质的概念、原理和方法。饱和硫酸铵溶液盐析沉淀法分离血清IgG的原理和操作方法。

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实验十 化学法测定DNA的含量

核酸含量测定在分子生物学研究和生物化学研究中经常会用到。核酸含量测定方法较多，例如紫外分光光度法、定磷法和定戊糖法等，本实验采用二苯胺法测定DNA的含量。

一、实验目的

1．掌握化学法——二苯胺法测定DNA含量的原理和操作方法。

二、实验原理

DNA 在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱和脱氧核糖，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，该化合物能与二苯胺试剂反应，生成蓝色化合物，此物质在595 nm 波长处有最大吸收。当DNA 在40-400 μg 范围内时，蓝色溶液的吸光值与DNA的浓度成正比，依次可以测定DNA的含量。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

三、实验操作步骤

取两支干净试管，按表10-1编号并加入试剂，混匀。

表10-1 化学法测定DNA的含量

0.01 mol/L NaOH溶液 DNA样品液 二苯胺试剂

空白 1 0 4

样品 0 1 4

置于60℃水浴中保温1h，冷却后，以空白管调零，于595nm 波长处测定样品管的光密度（OD595nm），查标准曲线，可得样品中DNA的含量。

DNA纯度计算：

DNA纯度?DNA测定值DNA测定值

%?%DNA样品值200DNA含量紫外分光光度法测定：

DNA浓度(?g/mL)?DNA纯度紫外分光光度法测定：

OD260 0.02 27

R?OD260 OD260一般RNA的R值大于2；DNA的R值在1.9左右；当蛋白质含量较高时R值下降。变性DNA的R值大于2.0。

比较两个方法测定DNA量差异，试说明原因。

四、实验试剂

1．DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺的DNA 钠盐，以0.01 mol/L NaOH 溶液配成200 μg/mL 的溶液。

2．测定样品溶液：准确称取干燥的DNA 制品，以0.01 mol/L NaOH 溶液配

成100-150 μg/mL 的溶液。若要测定RNA 制品中的DNA 含量，样品中至少要含有DNA 20 μg/mL 才能进行测定。

3．二苯胺试剂：称取1 g 二苯胺， 溶于100 mL 的分析纯的冰乙酸中，再加

入60 %以上的过氯酸10 mL，混匀待用。临用前加入1mL 的1.6 %乙醛，配好的试剂应为无色。

五、实验器材

分光光度计，恒温水浴箱，刻度吸管，微量移液器，试管 六、实验过程中应注意的问题：

二苯胺试剂有毒，注意安全；本实验所得测定值偏高。

七、实验考察点

DNA标准业的配制，化学法测定DNA含量的原理和操作方法，DNA纯度的测定方法，微量移液器的正确使用，分光光度计的正确使用，标准曲线的制作，标准曲线法测定物质含量的原理和操作方法。

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