动物生物化学实验教程正式(2)

六、实验过程中应注意的问题

该实验最关键的环节是酶促反应终点的判断，既不能过早又不能过晚；温度对酶活性影响实验中，试管从沸水中取出后，先用流动水冷却，再滴加碘液；加碘液时，应逐滴加，直到三管颜色不同为止。

七、本实验的考察点

实验原理；影响酶活性的因素及其作用规律，唾液淀粉酶稀释液的制备，最适温度、最适pH的测定方法，移液管的使用，酶动力学实验设计的方法（包括温度梯度、pH梯度的制作），连续取样法观测酶促反应进程，确定反应终点，观察和分析实验结果，通过推理得出合理的实验结论，实验报告撰写的格式。

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实验三 血液葡萄糖测定——福林—吴宪法

血液中所含的葡萄糖，称为血糖。它是糖在体内的运输形式。目前国内临床上多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。前者特异性强、价廉、方法简单；后者具有操作简单，特异性较高的优点，试剂成本也较低，但该方法一般需要在浓酸高温条件下发生反应, 因此在做血糖测定时必需多加注意。本实验采用福林—吴宪法测定血液中的葡萄糖。

一、实验目的

1．掌握福林-吴宪法测定血液葡萄糖含量的原理 2．掌握无蛋白滤液的制备方法

二、实验原理

血清中的葡萄糖和碱性铜在加热条件下反应，生成氧化亚铜，氧化亚铜与磷钼酸试剂反应生成蓝色物质，其溶液在420 nm波长处的光密度值与血糖浓度成正比，据此可以测定血液中葡萄糖的含量。

三、实验操作步骤

1．制备1∶10全血无蛋白滤液：取1份抗凝血，加入8份1/24 mol/L硫酸溶液，此时血细胞迅速破裂，颜色变黑，再加入10 %钨酸钠1份，摇匀，3000转/min 离心10 min，取上清液，过滤，得到无色澄清无蛋白滤液。

2． 取3支血糖管按表3-1加入试剂：

表3-1 福林-吴宪法测定血糖

试管号 蒸馏水（mL）

空白管 1.0

标准管 — 1.0 — 2.0

测定管 — — 1.0 2.0

标准葡萄糖应用液（mL） — 无蛋白滤液（mL） 碱性同试剂（mL）

— 2.0

混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，用流动自来水冷却三分钟（且勿摇动血糖管） 磷钼酸试剂（mL）

2.0

2.0

2.0

混匀后放置2分钟（使CO2气体逸出）

1∶4磷钼酸加至（mL）

12.5

12.5

12.5

1∶4磷钼酸溶液加至12.5 mL后，用橡皮赛塞紧管口，颠倒混匀，用空白管调0

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点在420nm波长处比色，读取各管光密度值，按下列公式计算100 mL血液中血糖的浓度：

葡萄糖（mg）测定管的光密度值100

??0.1?100mL标准管的光密度值0.1四、实验试剂

1．1/24 mol/L硫酸溶液：取浓硫酸（密度1.84）4.62 mL，加入到约500mL蒸馏水中，再定容至1000 mL。用0.lmol/LNaOH标定，调整至1/12 mol/L。

2．10 %（W/V）钨酸钠溶液：将钨酸钠（Na2WO4·2H2O）l0 g溶于蒸馏水，使全量至100 mL（此液呈弱碱性，取l0mL用0.l mol/L HCl溶液滴定，达中和时需0.l mol/L HCl 0.4 mL）。

3．碱性硫酸铜试剂： 取无水碳酸钠40 g溶于约400 mL蒸馏水中；酒石酸7.5 g溶于约300 mL蒸馏水中，结晶硫酸铜4.5 g溶于200 mL 水中，均加热助溶。冷却后，将酒石酸溶液倾入碳酸钠溶液中，混匀，移入1000 mL 容量瓶中，再将硫酸铜溶液倾入并加入蒸馏水至刻度。混匀，贮存于棕色瓶中。

4．磷钼酸试剂： 取钼酸（HMoO4）70 g和钨酸钠10 g，加入10 % NaOH溶液400 mL及蒸馏水400 mL，混合后煮沸20~40min，以除去钼酸中存在的氨（直至无氨味为止），冷却后加入浓磷酸（80 %）250 mL，混匀，最后以蒸馏水稀释至1000mL。

5．0.25% 苯甲酸溶液： 称取苯甲酸2.5 g，加入1000mL蒸馏水中，煮沸使溶解，冷却后补加蒸馏水至1000mL，贮于瓶中，可长期保存。

6．葡萄糖贮存标准液 （l0 mg/mL）： 将少量无水葡萄糖 (A.R或C.P)置于硫酸干燥器内过夜。精确称取此葡萄糖1.000 g，以0.25 %苯甲酸溶液溶解并转入100 mL容量瓶内，再以0.25 %苯甲酸溶液稀释至100 mL刻度，置冰箱中可长期保存。

7．葡萄糖应用标准液（0.l mg/mL）： 准确吸取葡萄糖贮存标准液1.0 mL，置100 mL容量瓶内，以0.25 %苯甲酸溶液稀释至100mL刻度。

8．1:4磷钼酸稀释液： 取磷钼酸试剂1份，加蒸馏水4份，混匀即可。 9．抗凝血：称取EDTANa2 16 mg于干净烧杯中，采集20 mL新鲜血液，摇匀，置于4℃冰箱备用。

五、实验器材

分光光度计，恒温水浴箱，刻度吸管，玻璃漏斗，血糖管，试管

六、实验过程中应注意的问题：

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一定要等水沸后再放入血糖管进行水浴加热；水浴箱中水面应高于血糖管中溶液的液面；加热时间必须准确；流动水冷却时切勿摇动试管；加入钼酸试剂后应及时放气。

七、本实验的考察点

福林——吴宪法进行血糖测定的原理，抗凝血制备，无蛋白滤液的制备，离心机的使用，血糖管的使用，实验测定数据的读数、纪录、处理，公式法计算血糖含量。

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实验四 血清总脂测定——香草醛法

血清总脂指血清中各种脂类的总和。测定血清总脂的方法有称量法、比色法、染色法等。其中称量法比较准确，可作为参考标准。比色法简单易行，为常用的测定方法，本实验采用香草醛法。

一、实验目的

1．学习总脂测定的原理和方法。 2．掌握微量吸管的正确使用方法。

二、实验原理

不饱和脂类物质在加热条件下，与浓硫酸发生反应，产生正碳粒子，正碳粒子与磷酸香草醛反应生成紫色物质，其溶液在525 nm处的吸光值，与脂的浓度成正比。

三、实验操作步骤

取3支洁净试管，按下表4-1操作。

表 4-1 香草醛法测定血清总脂

试管号 血清（mL）

空白管 —

标准管 — 0.02 1.0

测定管 0.02 — 1.0

标准液（mL） — 浓硫酸（mL） 1.0

充分混匀。放置沸水浴中加热10 min，使脂类水解，冷水冷却。 显色剂（mL） 4.0

4.0

4.0

用玻璃棒充分混匀，静置20 min（或37℃保温15 min）后，以空白管调“0点”， 在525 nm波长处，分别读取各管光密度。

实验结果计算：

血清总脂（mg）测定管的光密度值100测定管的光密度值??0.12???600

100mL标准管的光密度值0.02标准管的光密度值四、实验试剂

1．胆固醇标准液（6 mg/mL）：精确称取胆固醇600 mg，溶解于无水乙醇并定容至100 mL。

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