动物生物化学实验教程正式(5)

移液管，吸耳球，量筒，研钵，手术剪，剪刀，离心机，离心管，水浴锅

六、实验过程中应注意的问题：

心肌组织尽可能研磨成匀浆，加入石蜡油后，切勿摇动试管。

七、实验考察点

心肌组织匀浆抽提掖的制备方法，琥珀酸脱氢酶竞争性抑制的原理，琥珀酸脱氢酶竞争性抑制的观察方法的原理和操作。

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实验八 阳离子交换树脂纯化细胞色素c

层析技术具有操作简单、分离效率高、成本低等优点，被广泛应用于分离纯化技术领域，特别是在蛋白质分离纯化中，发挥着重要的作用。

层析是依据待分离混合物各组分的理化性质（表面电荷、溶解度、表面疏水性、分子大小，以及与固定相的选择结合性）的差异所建立的分离和分析技术。当待分离混合物通过由固定相和流动相组成的系统时，各组分与两相相互作用（溶解、吸附和结合），由于各组分的理化性质不同，在两相之间的分配存在差异。随着流动相的移动，各组份不断地在两相之间连续进行分配和再分配，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢，在相同的时间里移动的距离不同，这样就可以达到分离的目的，分离效果较好的层析系统，可得到样品中所含的各单一组份。

本实验依据采用阳离子交换树脂纯化细胞色素c，学习和掌握层析法分离纯化蛋白质的原理和一般操作流程。

一、实验目的：

1．学习层析技术的原理和一般操作过程。

2．学习阳离子交换树脂纯化细胞色素c的原理和操作方法。

二、实验原理

离子交换层析是利用离子交换剂与待分离的带电粒子之间亲和力（静电引力）的差异进行分离的层析技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和一定离子强度的电解质溶液。离子交换剂由三部分构成：不溶性高分子化合物、荷电基团和反离子。离子交换剂根据反离子可以分为：阳离子交换剂和阴离子交换剂。

Amberlite IRC-50为羧酸型阳离子交换树脂R-COOH。它以树脂为母体，引入羧基形成的弱酸型阳离子交换剂，使用前应先将交换剂转变为NH4+型，其荷电基团是羧基，反离子为氨离子。

细胞色素c是线粒体内呼吸链的组成成分之一，分子量较小（12000），等电点为10.7，pH为7时，带正电荷，因此用弱阳离子交换剂可以将其纯化。

Amberlite IRC-50纯化细胞色素c的原理如下：

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pCOONH4-+NaCOONH4+-+++p+COONap+-COOH-+COONH4-+

在pH7条件下树脂通过静电引力吸附细胞色素c，用蒸馏水洗掉不吸附的杂蛋白，然后增加洗脱液的离子强度，以0.06 mol/L Na2HPO4-0.4 mol/L NaCl洗脱，Na+交换细胞色素c，将其洗脱下来，达到分离纯化的目的。

三、实验操作步骤

（1）Amberlite IRC-50离子交换剂的预处理：

Amberlite IRC—50（H）树脂处理：取一定量的Amberlite IRC—50（H）（数量根据柱体积而定），用蒸馏水浸泡过夜，倾倒去水，加入2倍体积的2 mol/L HCl溶液，60 ℃恒温条件下电磁搅拌约1 h，倾倒去盐酸溶液，用无离子水洗涤至中性；加入2倍体积的2 mol/L NH4OH溶液，60℃恒温条件下搅拌l h，倾倒去氨溶液，再用无离子水洗至中性。

（2）离子交换纯化细胞色素c

装柱：将1×20 cm的层析柱垂直固定在铁架台上，关紧层析柱下端的出液口阀，用胶头滴管向层析柱中加入3 mL蒸馏水，然后吸取处理好的Amberlite IRC-50（NH4+）树脂溶浆，缓慢加入到层析柱中，使胶粒自由沉降，直至柱床高度为10 cm为止。（如果蒸馏水过多，打开层析柱下端的出液口阀，适当放出）

平衡：打开层析柱下端的出液口阀，用试管接收流出液，连续给层析柱缓慢加蒸馏水约10 mL，冲洗离子交换柱，至流出液的pH为7～8。（注意：柱床以上的蒸馏水高度不低于3 cm）

上样：关闭下端出液口阀，用胶头滴管吸去柱床面层以上的水，取1 mL细胞色素c样品液，缓缓加于柱床表面，打开层析柱下端的出液口阀，控制流速，使样品缓慢进入离子交换柱，关紧层析住下端出液口。（注意：让样品尽可能吸附在柱的上部，越集中越好，洗脱时样品易于集中，减少洗脱液体积。）

冲洗：上样完成后，在柱床面上先缓缓加入一层蒸馏水，打开层析柱下端出液口，用蒸馏水继续冲洗离子交换柱5～6 min，流速为1 mL/min（10滴/min），洗去不吸附的杂质。

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洗脱：冲洗完成后，关闭下端出液口阀，用胶头滴管吸去柱床面层以上的水，改用0.06 mol/ L Na2HPO4 ～0.4 mol/LNaCl溶液洗脱。先在柱床面上缓缓加入一层洗脱液，打开下端出液口阀，控制流速为1 mL/min（10 滴/min），用干净的试管接收洗出液，每10滴一管并按照次序编号。继续给层析柱中加洗脱液，始终保持接近满溢状态，直到，洗脱液为无色为止。

（3）细胞色素c含量的测定

观察各管颜色深浅，按照次序记录各管溶液体积。将相邻两管溶液合并，测定合并后各管溶液的细胞色素c浓度。细胞色素c浓度测定方法如下：

取于试管若干，编号，按照表8-1进行操作：

表8-1 细胞色素C含量的测定

0.06mol/lNa2HPO4—0.4mol/lNaCl缓冲液 适当稀释得细胞色素c溶液 0.01mol/l铁氰化钾溶液

空白 2.9 0 0.1

样品1 1.4 1.5 0.1

样品2 1.4 1.5 0.1

… … … …

混匀，以空白管为0，在550nm波长测定光密度值（OD）,按下列公式计算含量：

y(mg)?OD3?M?t??V(ml)?稀释倍数E1.5

其中，E为摩尔消光系数（2.77×104 /mol/cm）； 1.5为细胞色素C溶液得体积；Mωt为细胞色素c分子量（124000）； 3为比色时溶液的体积；V为制备所得细胞色素c溶液体积。

以各管累积体积为横轴，细胞色素c浓度为纵轴，画曲线。最后计算洗脱峰内各管的总体积和细胞色素c的总量。

累积体积的计算：

Vi??vn vn?0.2?xn

n?1n?iVi为第 I 管的累积体积；vn为第 n 管的体积，其中（1≤n≤i）；xn为第 n 管

的合并管数。

细胞色素c总量的计算：

m?NW(mg)??vcm?1mm

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W为细胞色素 c 的总量；N为总样品管数；vm为第 m管样品的体积；cm为为第m 管样品中细胞色素c的浓度。

（4）Amberlite IRC-50离子交换剂的再生

用过的AmberliteIRC—50(H)先用无离子水洗，再用2 mol/LNH4OH洗涤，倾倒碱水，用无离子水洗至近中性。加2 mol/L HCl溶液在60℃条件下搅拌20 min，倾去酸溶液。用无离子水洗至中性。再用2 mol/L NH4OH溶液浸泡，然后用无离子水洗至中性后即可使用。如长期不用，可用布氏漏斗抽干备用。

四、实验试剂

1. 细胞色素c样品液

2. 0.06 mol/LNa2HPO4-0.4 mol/LNaCl：称取21.5 g Na2HPO4·12H2O和23.4 g NaCl，加蒸馏水使之溶解，定容至1000 mL。

3. 0.01 mol/L铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾3.2925 g，加蒸馏水使之溶解，定容至1000 mL 。

4. 2 mol/L 氨水：取浓盐酸140 mL，用水稀释定容至1000 mL。 5. 2 mol/L 盐酸：取浓盐酸168 mL，用水稀释定容至1000 mL

五、实验器材

移液管，吸耳球，量筒，层析住，铁架台，层析柱夹，分光光度计，比色杯。

六、实验过程中应注意的问题：

装柱要均匀，上样量不宜 …… 此处隐藏：1631字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……