动物生物化学实验教程正式

实验一 血清蛋白质含量测定

牛血清蛋白：BSA。

血浆：指血液的液体成分，淡黄色（因含胆红素）。含白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原。血液经抗凝处理、离心沉淀后，获得的液体部分。

血清：血液凝固后，释出的液体。不含纤维蛋白原及游离钙离子。

蛋白质定量分析是动物生物化学和其他生命科学研究中经常用到的实验项目。蛋白质是生物体内最为重要的生物大分子之一，其种类繁多、结构多样、功能各异，而且分子量相差很大，所以很难建立一个理想而通用的蛋白质定量分析方法。目前测定蛋白质含量的方法很多，常用的测定方法有Folin—酚法（Lowry法）、紫外吸收法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染料结合法等，每种方法在实践中都有其优点和局限性。本实验采用考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）。(灵敏度最高)

一、实验目的

1．掌握分光光度法测定的原理，分光光度计的结构和基本操作要点

（光源-单色器-样品室-检测器-显示器）

2．掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理和操作方法 3．掌握微量移液器的使用方法

4．了解蛋白质含量测定中标准曲线的制作方法

二、实验原理

染料考马斯亮蓝G-250（R250，结合后可以解离）在游离状态下呈红色，最大吸收峰为465 nm。它能与蛋白质的疏水微区结合，形成蓝色复合物，该复合物的最大吸收峰为595 nm，在一定浓度范围内（为什么在一定范围内），其吸光度值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质含量的测定。

三、实验操作步骤

取两只干净的试管，按表1-1编号，并加入试剂，混匀。为什么空白管为0.9%NaCl？

表1-1 考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量

试管号

稀释的血清样品（mL） 0.9% NaCl 溶液（mL） 考马斯亮蓝G-250溶液（mL）

空白管

- 0.1 5

样品管 0.1 - 5

室温静置5 min，于波长595 nm处，以空白管调“0”，测定样品管的吸光度值，

查标准曲线，吸光度测定值所对应的蛋白质浓度就是稀释样品的蛋白质含量，然后乘以血清的稀释倍数（10倍），可得血清中蛋白质的含量。

四、实验试剂

1．考马斯亮蓝G-250溶液（0.01 %）：称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，溶于50 mL 95 %乙醇中，再加入100 mL 85 % (W/V) 浓磷酸，然后用蒸馏水定容至1000 mL，置棕色瓶过夜（如有不容物，可用二层滤纸过滤）。

2．0.9 % NaCl 溶液：称取NaCl 9 g，加水溶解，定容至1000 mL。 3．稀释血清：用0.9 % NaCl 溶液，将新鲜血清稀释10倍。 4．考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量的标准曲线绘制

蛋白质标准液（1 mg/mL）：小牛血清白蛋白100 mg加生理盐水至100 mL。 取11支干净试管编号，按表1-2加入试剂，混匀，室温静置3 min，于波长595 nm处，以0号管调“0”，测定样品管的吸光度值。

表1-2 考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的标准曲线绘制

编号 0

标准蛋白质溶液（μL） 0 0.9% NaCl 溶液（μL） 100 考马斯亮蓝G-250溶液（mL） 5

1 10 90 5

2 20 80 5

3 30 70 5

4 40 60 5

5 50 50 5

6 60 40 5

7 70 30 5

8 80 20 5

9 90 10 5

10 100 0 5

以各管的蛋白质浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。（表1-3）

表1-3 不同浓度标准蛋白质溶液对应的光密度值

管号 0 标准蛋白质溶液浓度（μg/mL） 0 光密度值

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

五、实验器材

分光光度计、试管、吸管、20-200 μL 量程微量移液器。

六、实验过程中应注意的问题

本法待测液 0.1 mL中含蛋白质10~80 μg为宜，如果样品蛋白质浓度过高，可用生理盐水适当稀释后再测。

七、实验的考察点

分光光度法的原理，分光光度计的构造、工作原理、一般操作方法及注意事项，考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理，实验测定数据的读数、纪录和处理，蛋白质含量测定标准曲线的制作，利用标准曲线测定蛋白质含量，移液管的正确使用，微量移液器的正确使用。

观察和分析实验结果，通过推理得出合理的实验结论，实验报告撰写的格式。

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实验二 唾液淀粉酶活性影响因素的观察

酶具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等优点，目前在科学研究、食品加工、饲料生产、医疗卫生等领域具有广泛的应用。但是酶的活性很容易受到环境条件的影响，例如温度、pH值、激活剂、抑制剂等，因此在实际应用之前，必须首先考虑酶的动力学性质，以及影响酶活性的各种因素。本实验以唾液淀粉酶为对象观察影响酶酶活性的各种因素，是酶学研究和应用的基本实验。

一、实验目的

1．通过实验了解酶的基本性质及影响酶活性的各种因素 2．学习测定酶的最适温度、最适pH值的方法

二、实验原理

唾液淀粉酶能将淀粉水解为糊精、极限糊精、麦芽糖等，这些产物与碘反应产生不同的颜色，因此可以根据显色的差异，判断化学反应速度的大小，从而确定酶活性的高低。本实验通过改变影响唾液淀粉酶活性的一种因素，控制酶促反应体系中的其他因素，使其保持一致，观测酶促反应速度，以分析单个因素对唾液淀粉酶活性的影响。

三、实验操作步骤

（一）唾液淀粉酶的制备：每人用自来水漱口3次，然后取20 mL蒸馏水含于口中，做咀嚼动作，3 min分钟后，吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液10 mL，稀释至20 mL，获得稀释唾液。

（二）酶活性影响因素的观察 1．温度对酶活性的影响

（1）取3支试管，编号后按表2-1加入试剂，混匀，置于相应温度下反应。

表2-1 温度对酶活性的影响

试管号 1 2 3

0.5 %的淀粉溶液

（mL） 3 3 3

pH6.8的缓冲液

（mL） 0.5 0.5 0.5

稀释唾液（mL） 1 1 1

温度 ℃ 0 37 100

（2）取碘液2滴于白色比色板的各反应孔中，自试管放入水浴箱后，每隔1 min

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从2号管中取反应液1滴，与其中一个反应孔内的碘液混合，观察颜色变化。

（3）待2号管中的反应液遇碘液不发生颜色变化（即呈碘色）时，向各管中加入碘液2滴，摇匀，观察并记录各管颜色（注意：第三管需自来水冷却，否则不显蓝色），根据观察结果分析温度对酶活性的影响，并确定唾液淀粉酶的最适温度。

2．pH对酶活性的影响

（1）取3支试管，编号后按表2-2加入试剂：

表2-2 pH对酶活性的影响

试管号 1

2 3

0.5 %的淀粉溶液

（mL） 2 2 2

pH5.0缓冲液（mL） 2 0 0

pH6.8缓冲液（mL） 0 2 0

pH8.0缓冲液（mL） 0 0 2

稀释唾液（mL） 1 1 1

（2）摇匀，置于37℃ 水浴箱保温。取碘液2滴于白色比色板的各反应孔中，自试管放入水浴后，每隔1 min，从2号管中取反应液1滴，与其中一个反应孔内的碘液混合，观察颜色变化，直至呈碘色。

（3）取出3个试管，立即各自加入碘液2滴，充分摇匀，观察各管呈现的颜色，判断不同pH值中淀粉水解的程度，并确定最适pH。

3．酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响 （1）取3支试管，编号后按表2-3加入试剂：

表2-3 激活剂及抑制剂对酶活性的 …… 此处隐藏：2592字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……