动物生物化学实验教程正式(3)

2．显色剂：先配置0.6 %的香草醛水溶液200 mL，再加入浓磷酸800 mL。贮存于棕色瓶中可保存6个月。

3．浓硫酸（分析纯，含量95 %以上）。 4．浓磷酸（分析纯，含量85 %以上）。

五、实验器材

分光光度计，恒温水浴箱，刻度吸管，微量移液器，试管

六、实验过程中应注意的问题：

实验过程中切勿将试剂洒落实验台、粘附于器皿外或衣物上；试管应干燥；尽量将试剂加入到试管底部。

七、实验考察点

混合成分含量测定的原理和方法，香草醛法测定血脂的操作流程，胆固醇作为标准的理由及其对实验结果的解释，胆固醇标准液的配制、用移液管移取黏度较大的液体，微量液体的使用，水浴锅的使用。

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实验五 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

电泳技术是蛋白质和核酸研究中最常用的生物化学技术。电泳是指带电粒子在电场中的定向移动，不同的带电粒子由于电荷的差异，在电场中的迁移率不同，所以在相同时间内，它们迁移的距离不同，据此可以将其分开。蛋白质是两性电解质，在不同的缓冲液中所带电荷的极性与数量会有所不同，因而在电场中的行为也相应地会有所不同，因此可以采用电泳的方法将其分离。

一、目的

1．学习电泳的一般原理和方法。

2．掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的技术。

二、实验原理

带电粒子在电场中的定向移动称为电泳。醋酸纤维薄膜电泳是用用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，有强渗透性，对分子移动无阻力。

蛋白质是两性电解质，在pH

血清中主要含有白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，在pH8.6的缓冲溶液中，此5种蛋白质都带负电，在电场中都向正极移动，但由于这5种蛋白质的相对分子量、等电点及形状等不同，它们在电场中的移动速度不同，故采用电泳的方法可以将其分离。

三、实验操作步骤

（一）仪器和薄膜的准备 1．醋酸纤维薄膜的润湿和选择

将薄膜裁成（2×8cm）条状，使其漂在缓冲液液面上，如果迅速湿润，而且整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀（实验中应选择质地均匀的薄膜）。然后再用竹夹轻轻将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全浸透后使用。

2．制作电桥

将电泳电极缓冲液倒入电泳槽两边的缓冲液池中，并用虹吸管平衡两侧的液面。

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根据电泳槽的纵向尺寸，于两电极槽各放入四层纱布，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上。它们的作用是联系薄膜与两端电极缓冲液之间的中间“桥梁”。

（二）点样

取出浸透的薄膜，平放在滤纸上（无光泽面朝上），轻轻吸去多余的缓冲液。取血清0.1 mL放于洁净载玻片上，再加上0.5 mL 0.03 %溴酚蓝，混匀。用点样器蘸一下（约2-3 mL），再“印”在薄膜的点样区。注意，应使血清均匀的分布在点样区内，这是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。

点样区

3mm 2cm

（三）电泳

将点好样的薄膜（无光泽面朝下）两端紧贴在支架的纱布上。平衡十分钟，接通电源（负极靠点样端），调节电流为0.4-0.6 mA（薄膜每厘米宽），电压为每厘米长10-12 V（总电压60~70 V），电泳45-60 min。

（四）染色

电泳完毕，关闭电源，立即取出薄膜，直接浸入染色液中5 min。然后用漂洗液漂洗，每隔10 min左右换一次漂洗液，连续两次，使背景颜色脱去，夹在滤纸中吸干。

（五）结果判断

一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1

球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、和г球蛋白。

（六）透明

将用滤纸吸干的薄膜，浸入透明液甲液中，2 min后立即取出，并进入透明液的乙液中，1 min（要准确）后迅速取出，紧贴在载物片上，赶走气泡。约2-3 min内薄膜完全透明，待干后置于切片盒中，可长期保存。

正极

负极

清蛋白 α1 α2 β г 原点 12

四、实验试剂

1．新鲜血清

2．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：称取巴比妥钠12.76 g，巴比妥1.66 g，加蒸馏水加热溶解，稀释至1000 mL。

3．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5 g，甲醇50 mL，冰醋酸l0 mL，加水至100mL。

4．漂洗液：95 ％乙醇45 mL、冰醋酸5 mL和蒸馏水50 mL，混匀。

5．透明液：

甲液：冰醋酸15 mL和无水乙醇85 mL混匀。 乙液：冰醋酸25 mL和无水乙醇75 mL混匀。

五、实验器材

醋酸纤维薄膜（2×8cm）、电泳仪、薄膜电泳槽、点样器（盖玻片）、培养皿、粗滤纸、玻璃板（载玻片）、镊子

六、实验过程中应注意的问题：

点样式关键，要少、轻、直、匀；不要将薄膜吸得过干；漂洗时不要用镊子来回拉动；节约漂洗液，要注意电流强度。

七、实验的考察点

电泳的一般原理和操作步骤，SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量的原理，醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和操作步骤。

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实验六 碱性磷酸酯酶的分离与制备

酶是一种蛋白质，具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等优点，目前在科学研究、食品加工、饲料生产、医疗卫生等方面具有广泛的应用。无论是在基础研究中，还是在实际生产中，必须对酶进行分离和纯化，因此，酶的分离纯化是酶学研究和应用，乃至蛋白质科学研究和生命科学研究的基础。

碱性磷酸酯酶（ALP或AKP）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向外排出的一种酶。碱性磷酸酯酶主要功能是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。碱性磷酸酯酶是分子生物技术常用的工具酶之一，也是免疫诊断试剂产品最常用的标记酶，临床上，碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。

有机溶剂分级沉淀法是分离蛋白质的常用方法之一，有机溶剂能使很多溶于水的生物大分子发生时沉淀，不同的蛋白质在不同浓度的不同有机溶中的溶解度不同。。本实验依据碱性磷酸酯酶的性质，采用有机溶剂分级沉淀法提取分离碱性磷酸酯酶。

一、实验目的：

1．通过实验了解蛋白质分离提取的一般流程和方法

2．学习使用有机溶剂分级沉淀法分离蛋白质的原理和一般方法

3. 掌握有机溶剂分级沉淀法从肝组织中提取分离碱性磷酸酯酶的原理和方法。

二、实验原理

有机溶剂沉淀蛋白质的原理是降低水溶液的介电常数和通过氢键破坏蛋白质表面的水化膜，从而使蛋白质凝聚成团，最后沉淀出来。因此，可以通过逐步改变样品溶液中有机溶剂的浓度和比例，使不同的蛋白质依次沉淀出来，利用这种方法分离蛋白质的方法，称为有机溶剂分级沉淀法。

本实验依据碱性磷酸酯酶溶解于33 %丙酮溶液或30 %乙醇溶液，而在50 %丙酮溶液或60 %乙醇溶液中沉淀，采用有机溶剂分级沉淀法分离碱性磷酸酯酶。

三、实验操作

以下操作均在4—10 ℃进行 （1）材料预处理和匀浆 …… 此处隐藏：1122字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……