动物生物化学实验教程正式(4)

称取新鲜兔肝2 g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入2.0 mL 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆转移至离心管中，用上述溶液4.0mL分2次冲洗匀浆管，幷倒入离心管中，混匀，此为A液。 （2）抽提和过滤

加2.0 mL正丁醇于上述剩余的匀浆液中，口对底上下颠倒充分混匀2 min。然后在室温放置20 min，滤纸过滤，滤液置于离心管中。

（3）丙酮沉淀浓缩

取4 mL的抽提液（A液）于离心管中，加入等体积（4 mL）冷丙酮，立即混匀后离心5 min（2000r/min），弃上清液，向沉淀中加入4.0 mL 0.5 mol/L醋酸镁溶液，震荡使其充分溶解，为B液。

（4）乙醇分级沉淀

取4 mL B液于离心管中，加入95 %冷乙醇1.84 mL，使乙醇浓度为30 %，混匀，立即离心5 min（2000r/min），将上清液倒入另一只离心管中，弃去沉淀，取上清液4 mL于新离心管中，加入95 %冷乙醇3.435 mL，使乙醇浓度达60 %，混匀后立即离心5 min（2500r/min），弃上清液。向沉淀中加入4.0 mL 0.01 mol/L醋酸镁—0.01 mol/L醋酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解，为C液。

（6）丙酮分级沉淀

取4 mLC液于离心管中，加入冷丙酮1.97 mL，使丙酮浓度为33%，混匀，立即离心5 min（2000r/min），将上清液倒入另一只离心管中，弃去沉淀，取上清液4 mL于新离心管中，加入冷丙酮1.36mL，使丙酮浓度为50%，混匀后立即离心15 min（3800 r/min）,弃上清液。所得沉淀即为初步纯化的碱性磷酸酶。

（7）提取产物的鉴定

给沉淀中加入1 mLTris-HCl缓冲液（pH8.8）充分震荡摇匀，使酶溶解，再加入1 mL底物液，37℃水浴15 min，加入NaOH溶液1mL，4-氨基安替比林1 mL，铁氰化钾溶液2 mL，37℃水浴10 min，观察溶液颜色，如果颜色变红，提取物即为碱性磷酸酶，颜色越深，酶活力越高。

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肝脏碱性磷酸酯酶分离实验技术路线

四、实验试剂

1．新鲜肝脏

2．0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取107.25 g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000 mL，再徐徐倒入90 mL沸水，同时不断搅拌，最后用蒸馏水定容至100 mL。

3．0.1 mol/L 醋酸钠溶液：称取8.2 g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 mL。 4．0.01mol/L 醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液：准确吸取20 mL 0.5 mol/L醋酸镁溶液及100 mL 0.1 mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 mL。

5．Tris-HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，即为0.1 mol/L Tris溶液。取100 mL 0.1mol/L Tris溶液，加蒸馏水约780 mL，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混匀后用1%冰醋酸调 PH为8.8，用蒸馏水定容至1000 mL。

6．40 mmol/L底物液：称取磷酸苯二钠11.56 g，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，定容至1000mL。

7．0.5 mol/LNaOH溶液：称取NaOH34.5 g，溶于1000 mL的蒸馏水中。 8．0.3 %（W/V）4-氨基安替比林溶液：称取0.3 g 4-氨基安替比林及4.2 g硫酸氢钠，用蒸馏水溶解至100 mL。

9. 0.5 %（W/V）铁氰化钾溶液：称取0.5 g铁氰化钾和15 g硼酸，各溶于400 mL蒸馏水中，溶解后两溶液混合，再用蒸馏水定容至1000 mL。

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10. 正丁醇，丙酮，95 %乙醇均为分析纯试剂。

五、实验器材

移液管水吸耳球水量筒，玻璃匀浆器浆剪刀，离心机心离心管心水浴锅，新华定性滤纸

六、实验过程中应注意的问题：

离心时一定要平衡，正确选择离心力，正确判断取上清夜还是沉淀，准确计算加入有机溶剂的量，有机溶剂一定要预冷。

七、实验考察点

玻璃匀浆器的正确使用、离心机、有机溶剂分级沉淀分离蛋白质的原理、肝脏碱性磷酸酯酶分离的实验原理和操作流程，碱性磷酸酯酶的鉴定方法。

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实验七 琥珀酸脱氢酶竞争性抑制观察

无论在生物体内，还是在科研和生产中，影响酶的活性的因素很多，其中研究酶的抑制作用具有重要的意义。在酶的抑制作用中，竞争性抑制是酶可逆抑制的重要方式。研究酶的竞争性抑制的规律，对于研究酶在体内的调节方式、药物开发，以及科研和生产等酶的各种应用领域具有重要的意义

琥珀酸脱氢酶为呼吸链中的复合体II，在呼吸作用较强的组织（心肌、骨骼肌、肝脏等）细胞中含量丰富，其以琥珀酸为底物，产生还原氢。丙二酸为琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

本实验先从心肌组织中抽提细胞匀浆液，获得琥珀酸脱氢酶，利用琥珀酸的类似物丙二酸为竞争性抑制剂，观察琥珀脱氢酶的竞争性抑制现象。

一、实验目的：

1. 掌握心肌细胞匀浆液的制备方法。

2. 观察无氧条件下琥珀酸脱氢酶竞争性抑制作用。

二、实验原理

存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氢酶，能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，同时产生还原氢，还原氢可使甲烯蓝褪色，还原为甲稀白。草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争的和琥珀酸脱氢酸的活性中心结合而产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中的浓度和相对比例。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝褪色的程度，从而探索丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制的规律性。反应如下： COOHCH2COOHCH2CH2COOH琥珀酸COOHCHCHCOOH延胡索酸FADH 2MB甲烯兰琥珀酸脱氢酶FADMBH2甲烯白O2COOH丙二酸 18

三、实验操作步骤

（1）猪心肌组织匀浆液的制备:

称取新鲜猪心肌组织1.5-2 g放置研钵中剪碎加入等体积的石英沙和pH7.4的0.10 mol/L磷酸盐缓冲液3-4 mL匀浆（在研钵中充分研磨），研磨成匀浆后加入上述的缓冲液6-7 mL。

（2）猪心肌组织细胞基质抽提液的制备：

将匀浆液置于离心管中静置20 min（放置过程中要上下颠倒轻摇数次），2000 r/min离心10min,得上清液。

（3）琥珀酸竞争性抑制的观察

取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：

表7-1 琥珀酸竞争性抑制的观察

试管号 1 2 3 4

0.093mol/L琥珀酸钠

（滴） 5 5

5 20

0.10mol/L丙二酸钠

（滴） — —

5 5

蒸馏水（滴） 25 25 15 —

心肌匀浆液（滴） 5 5（煮沸）

10 10

0.02%甲烯蓝（滴） 2 2

2 2

摇匀，给每个试管溶液上部加5滴石蜡油，37 ℃水浴30 min，其间每隔10 min观察溶液颜色，并记录实验结果。

（4）最后振荡1号试管，观察颜色变化，记录并解释这种现象。

四、实验试剂

1. 新鲜动物心脏

2. 1.5 %（w/v）琥珀酸钠溶液（0.093 mol/L）：称取1.5 g琥珀酸钠，用蒸馏

水溶解并稀释到100 mL。（若无琥珀酸钠，则可以用琥珀酸配成水溶液后，再用NaOH溶液中和至pH7-8）。

3. 3 .1 %（w/v）丙二酸钠溶液（0.10 mol/L）：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶

解并稀释到100mL。 4. 0.02 %（w/v）甲烯蓝溶液。

5. 1/15 mol/L Na2HPO4溶液：称取Na2HPO4·2H2O 11.8 g，用蒸馏水溶解并稀

释到1000 mL。 6. 液体石蜡油。

五、实验器材

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