植物生理生化实验(2)

实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶—垂直板法 P180

原理：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生不同的泳动速率而相互分离。利用特异性的显色反应使待测酶蛋白染色后，就可在凝胶中呈现电泳酶谱。

过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种类及活性的调节。利用过氧化物酶催化H2O2分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物同工酶酶谱。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

操作步骤：安装→制分离胶（分离胶缓冲液PH8.9 3ml、分离胶贮液6ml、H2O 2ml、过硫酸铵溶液12ml）→灌注（胶面加0.5cm水层，静置20min至水层底下有一清晰界面，倒去水层用滤纸吸干）→制浓缩胶（浓缩胶缓冲液PH6.7 0.5ml、浓缩胶贮备液1ml、H2O 1ml、过硫酸铵溶液2ml）→灌注（用水封液面，放样品梳，静置10min，凝固后取出样品梳，用滤纸吸水）→上样（离心后1ml样品提取液+20%蔗糖至胶的凹槽）→电泳（电极上、下加电极缓冲液，上槽1滴溴酚蓝，恒压100-120V、120-140V，当溴酚蓝达距管底0.5cm处时切断电源）→剥胶→染色（0.5ml联苯胺母液+9.3ml H2O+0.2ml3%H2O2，混匀倒入盛凝胶的培养皿，10min后用水冲洗）

注意事项：

1. 玻璃要干燥并夹好；

2. 凝胶配置好要马上灌胶，过硫酸铵要现配现用，染料要现配现用； 3. 针头推出胶液时，针头慢慢向上移动，直至刻度线处； 4. 附着在研钵壁上的研磨样品要洗下并全部转入离心管； 5. 电极缓冲液慢慢加入每支试管直至浸没顶部为止； 6. 电泳时要控制电流，不可超过170V；

7. 剥胶时，长针头注射器吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢将注射器中的溶液推出，并不断转动凝

胶管。

思考题：

1. 简述试验中过硫酸铵、四甲基乙二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用？ 过硫酸铵：催化剂，提供过硫酸铵自由基；

四甲基乙二胺：加速剂，加速过硫酸铵形成自由基；

蔗糖：粘性好，不易扩散，能使样品在样品槽里不易散开；

溴酚蓝：指示剂，电泳时比蛋白质快，从而得知反应进行的程度； H2O2：过氧化同工酶底物。

2. 试比较垂直板型和圆盘凝胶电泳的优缺点。

垂直板型凝胶电泳法： 优点：可同时点样，使结果直观化。 缺点：易漏胶，使实验失败。 圆盘式凝胶电泳法： 优点：不易漏胶。 缺点：不能同时点样，染色后不易比较结果。

6

实验一 植物抗逆性的测定—电导仪法 P282

原理：植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物收到逆境影响时，如高温或低温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞浸液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗逆性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。

材料：桂花叶片（正常、高温50℃/低温-20℃）

操作步骤：将玻璃仪器及桂花叶片用去离子水洗净、擦干。分别给叶片打孔，每种叶片打30个小叶片，每种分2组。如下操作 叶片 去离子水ml 真空抽气 水分交换 测初电导值 杀死细胞 测终电导值 相对电导度 伤害率 KA’=8.8 KB1’=36 0.092 KA=6.7 KB1=9.5 空白 15 15 15 正常叶 15 15 15 15 低温 15 15 15 15 高温 15 15 抽气10min，叶片下沉 室温静置20min，摇晃 KB2=8.7 KB2’=33.9 KC1=30.1 KC1’=62.2 KC2=30.4 KC2’=59.2 KD1=16.9 KD2=14.4 沸水浴煮10min，冷却至室温 KD1’=56.8 KD2’=53.4 0.193 11.1% 0.454 39.9% ①正常叶片相对电导率=KB-KA/KB’-KA’ ②处理叶片相对电导率=KC-KA/KC’-KA’ 膜伤害率=②-①/1-① *100%

注意事项：

1. 整个过程中，去离子水要使用同一洗瓶中的，减少误差；

2. 全部器皿要用去离子水洗净，洗净后的叶片接触的用具必须绝对洁净，也不能用手直接触碰； 3. 电导率的测定要在同一温度下，每次测定前要用去离子水清洗并用吸水纸吸干电极； 4. 使用电导仪时量程调至199.9us，若起始不为零，需要机械调零。

思考题：

1. 植物抗逆性与细胞膜透性有何关系？

在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。

2. 为什么要用真空抽气？为什么要充分振荡？

真空抽气使细胞间隙中的电解质与外界水分交换，使得细胞内、外电解质平衡。此时，测定溶液电导度即是测定植物细胞内的电导度。

充分振荡使附在叶片或附近的电解质能充分溶解在水中，减少误差。

7

实验二 植物组织水势的测定--小液流法 P109

原理：将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。因溶液的浓度是已知的，可根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势（φπ），即代表植物的水势（φW）。φW=φπ=-P=-iCRT

材料：灰莉叶片

操作步骤：取叶片打小圆片50片，如下操作 编号 蔗糖溶液 蒸馏水 溶液浓度 液滴移动方向 1 0.5 9.5 0.05 ↓ 2 1 9 0.1 ↓ 3 2 8 0.2 ↑ 4 3 7 0.3 ↑ 5 4 6 0.4 ↑ 6 5 5 0.5 ↑ C=0.1+0.2/2 ；φW=φπ=-P=-iCRT

注意事项：

1. 叶片打孔要在同一部位，并避免主脉； 2. 玻璃仪器要干燥洁净；

3. 小叶片与溶液要混合均匀； 4. 甲烯蓝不能加太多； 5. 蔗糖溶液用前要摇匀；

6. 叶片打完孔，立即放入青霉素瓶并加入蔗糖； 7. 最后毛细管放液滴时要缓慢。

思考题：

1. 试述小液流法测定植物组织水势的原理？

讲植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，如果植物组织的水势小于某一溶液的水势，则组织吸水，反之失水。当到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。由于溶液浓度已知，可根据公式算出其渗透压，取负值即代表植物的水势。

2. 小液流法测定植物组织水势时为什么操作时，应强调所用试管、毛细管应保持干燥？打取小圆片并投

入到试管中时动作应迅速？加入甲烯蓝不能太多？

所用仪器若不干燥，其所含水分会影响所配溶液浓度并对实验结果造成误差； 所打小圆片要迅速投入试剂中，为的是避免小圆片失水，造成误差；

甲烯蓝若加太多，会使叶片组织水势低于该蔗糖溶液的渗透势，造成误差。

8

实验三 植物的无土培养和 …… 此处隐藏：3909字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……