植物生理生化实验

实验一 植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199

原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 ①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。

②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：

分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100ml。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作 试管编号 试剂 样品提取液ml 无氨蒸馏水ml 0.1抗坏血酸ml 水合茚三酮ml 570nmOD值 每管含氮量 0 0 空白1 0 2.0 0.1 3 0.130 1.26 样品1（未萌发） 2 2 0 0.1 3 0.123 1.19 3 2 0 0.1 3 0.188 1．83 样品2（萌发） 4 2 0 0.1 3 0.168 1.83 5 2 0 0.1 3 置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm波长下测定吸光度。 样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CVT/VSW *100 ；C=A/k (k=0.103) ； VT=100/2 ； VS=1 ； W=1

注意事项：

1. 测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水； 2. 样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；

3. 抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；

4. 水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于

90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇； 5. 稀释后要迅速比色；

6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量； 7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。

思考题：

1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？

不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。 2. 测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？

可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。 3. 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？ 因为植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。 10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。 4. 抗坏血酸在测定中的作用是什么？

作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。

722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%。②吸光度模式

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实验二 植物组织可溶性蛋白质含量测定—Folin酚试剂法 P188

原理：Folin酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。 ①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物。

②络合物和蛋白质中氨基酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质。

在一定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在650nm，因此可用分光光度法测定其含量。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：

分别取0.5g萌发、未萌发水稻于研钵中+2ml蒸馏水+石英砂，充分研磨，+3ml蒸馏水，定容25ml，放置15min，过滤取上清液备用。如下操作 编号 牛血清蛋白250ug/ml 蒸馏水ml 试剂甲ml 试剂乙ml 1 0 1．0 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 5 摇匀→室温下放置10min 0.5 迅速摇匀→室温放置30min 650nmOD值 蛋白质含量 0.000 0 0.112 50 0.154 100 0.255 150 0.474 200 0.551 250 0.167 71.8 0.237 104.8 6 1.0 0 未萌发 酶0.5 0.5 萌发 酶0.5 0.5 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=XVTN/WVS *1000 ；VT=25；W=0.5；VS =0.5

注意事项：

1. Folin酚试剂只有在酸性条件下才稳定； 2. 试剂甲、试剂乙加入后需要迅速摇匀； 3. 反应最适温度在25-30℃；

4. 样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基类化合物均会产生干扰。

思考题：

1. 请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并比较其优缺点。

①Folin-酚试剂法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰 ②考马斯亮蓝G-250法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：易造成二次污染 ③紫外分光光度法 优点：节约样品、操作简单 缺点：准确度差

2. 测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举例说明。 可以测定植物的代谢水平、食品中的营养指标。

3. Folin-酚试剂法测定可溶性蛋白的原理是什么？测定中应注意什么问题？ 原理。。。

测定时要注意最适温度为25-30℃，Folin-酚试剂只有在酸性条件下才稳定，并会受到柠檬酸等化合物的干扰。

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实验三 植物组织Vc含量测定—滴定法 P268

原理：Vc具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当用蓝色碱性2,6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型。但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，则再滴加2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色，借此可指示滴定终点。根据滴定消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可计算出被测样品中抗坏血酸的含量。

材料：白萝卜

操作步骤：5g白萝卜于研钵中，加入少量2%草酸和石英砂，快速研磨成匀浆，用2%草酸洗入100ml容量瓶中并定容，过滤，滤液备用。以2,6-二氯酚靛酚溶液滴定呈粉红色，并在15s内不褪色为终点。 试剂 2%草酸 标准VC(20ug/ml) 样品提取液ml 2,6-二氯酚靛酚燃料滴定ml 1空白 10 0 0 0.15 Y1 2染料标定ml 3染料标定ml 0 10 0 2.78V1 0 10 0 2.75V1 4样品ml 0 0 10 0.98Y0 5样品ml 0 0 10 1.02Y0 样品VC含量（mg/100g鲜重）=（YO-Y1）A/W *VT/VS *100 ； A=10ml*20/V1-Y1 *10-3 VT=100 ； VS=10 ；W=5

注意事项：

1. VC很容易被还原，研磨要快速，滴定也应控制在2min以内； 2. 2,6-二氯酚靛酚很不稳定，每次实验时需重新测定浓度； 3. 若样品溶液有较多泡沫，可适当加丁醇

思考题：

1. 为什么在测定VC的同时要进行2,6-二氯酚靛酚溶液的标定？

2,6-二氯酚靛酚溶液很不稳定。

2. 为了保证抗坏血酸含量准确测定，操作过程应注意些什么？

VC很容易被还原，需要快速研磨、快速匀浆、快速滴定，并要避免阳光直射，避免用铜、铁器具接触白萝卜。并用2%草酸抑制酶活性，避免VC分解。

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实验四 植物硝酸还原酶活性的测定—活体法 P126

原理：NR催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生产红色偶氮化合物。在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。NR活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

材料：甘薯叶片

操作步骤：取2张不同的甘薯叶片，洗净后吸干水分，打孔后混匀，迅速取0.3-0.4g样品3份于三角瓶 …… 此处隐藏：3826字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……