miRNA靶基因实验验证的研究进展

研究进展

重舅医学２００９年１月第３８卷第２期 综

述

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ｍｉＲＮＡ靶基因实验验证的研究进展

曹学武综述，陈正堂△审校

（第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所，重庆４０００３７）

关键词：ｍｉＲＮＡ；生物信息学；ｍＲＮＡ；共表达；３，一ＵＴＲ；结合位点

中图分类号：Ｑ７８６

文献标识码：Ａ

ｍｉＲＮＡｓ是一大类非蛋白编码的小分子ＲＮＡ。他们已成为基因表达的重要调节因子¨引。目前已有约５００个ｒｎＲＮＡｓ被分离并鉴定［４］。然而。目前有研究报道人类基因组中含有约

１

０００个ｍｉＲＮＡｓ［５玎】。ｍｉＲＮＡｓ通过使其靶ｍＲＮＡｓ的翻译抑制或降解来抑制基因表达［７…。每个ｍｉＲＮＡ都有数百个进化上保守的靶基因，以及几倍的非保守的靶基因。目前估计人类３０％的基因可能被ｍｉＲＮＡｓ调控［１…。

ｍｉＲＮＡ靶基因的鉴定已成为一个巨大的挑战。在ｍｉＲ－ＮＡ靶基因预测方面，生物信息学的计算方法已成为最主要的推动力［２¨“。这些计算方法主要利用程序来鉴定和校正ｍｉＲ－ＮＡ的３’－ＵＴＲ内与ｍｉＲＮＡ的种子序列互补的位点，以及这些同源基因３，．ＵＴＲ内互补序列在种系发生学上的保守性。

然而，有证据显示，完全种子序列的配对不一定是一个可靠的

ｍｉＲＮＡ相瓦作用的指标［１Ｓ３，这可解释为什么一些预测的靶位点不具功能性。因此，除极少个例外。绝大部分生理学及临床相关的ｍｉＲＮＡ的靶基冈需要通过实验进行鉴定或验证。

目前对于应遵循什么标准来确定ｍｉＲＮＡ的靶基因及证实其生物学效能没有明确的一致意见。因此本综述的目的是探讨一套指导原则，以便研究者可参考这套原则来验证一个给定的ｍｉＲＮＡ是否调控一个特异的靶ｍＲＮＡ。同时本综述也探讨一些可以用来验证ｍｉＲＮＡ靶ｍＲＮＡ的实验程序。基于Ｍａｒｔｉｎ等［１６“７］的实验研究，为了减少生物信息学预测到的ｍｉＲＮＡ结合位点，加速感兴趣的靶位点的生物学验证，可建立一套工作流程图。在完成生物信息学的预测后，可分别进行ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ相互作用的功能学验证和结构学验证。

１常用的生物信息学预测方法

１．１

ｍｉＲＮＡ靶的生物信息学预测当开始研究一基因是否

为一个ｍｉＲＮＡ调控的靶基因时，可以用不同的生物信息学计算方法来分析每个序列（如ｍＲＮＡ的３’－ＵＴＲ区序列），这些计算方法采用不同的参数来预测一个给定的靶ｍＲＮＡ内具功能性ｍｉＲＮＡ结合位点的可能性。由于每种计算方法的有效性不同，下面３种计算方法应该被用来预测ｍｉＲＮＡ结合位点：ｍｉＲａｎｄａ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ和ＰｉｃＴａｒ。这３种计算方法都允许研究者输入一个基因符号，这些计算方法将计算此基因内所有预测的ｍｉＲＮＡ结合位点。此外，这些计算方法可测定一个给定的ｍｉＲＮＡ所有的靶ｍＲＮＡ。因为不同的计算方法会预测

出不同的ｍｉＲＮＡ结合位点，所＿以同时使用多种计算方法进行

预测非常必要。值得注意的是，尽管ｍｉＲＮＡ结合位点在不同物种间的保守性是各种不同计算方法的组成部分，但并不是一个功能性位点所必需的。由于不同计算方法预测的结果存在很大的差异，如何确定哪些预测的结合位点需要进一步的实验验’征成为研究者要面临的一个难题。作者认为至少这３种计

．Ｉ．＿Ｌ．‘Ｌ．‘．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一

△通讯作者。

万方数据

文章编号：１６７１—８３４８（２００９）０２－０２１１—０３

算方法中的２种计算方法均预测到的ｍｉＲＮＡ结合位点，有必要进一步用实验验证。

１．２

ｍｉＲＮＡ可接近性分析因为很多经种子序列匹配预测

的ｍｉＲＮＡ靶经体内验证实验证实并不是真的ｍｉＲＮＡ靶，为了起始一步减少预测到的抑制一给定的靶ｔｕＲＮＡ表达的ｍｉＲＮＡ的数量，进一步的程序分析是有必要的。结构特征控制着ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ间的相互作用的观点已被越来越多的人所接受。例如，一个ＲＮＡ分子的大部分结构是高度复杂性的，只彳Ｉ特定的单链区域允许ｍｉＲＮＡｓ接近并与互补位点结合。因此，复杂的ＲＮＡ二级结构可能阻止ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ的相互作用。最近Ｚｈａｏ等Ｄｓ，ａ９３的研究证实，绝大部分已证实的靶的一个共同特征是优先与基于热动力学在ＲＮＡ分子中容易接近且没有复杂二级结构的３，－ＵＴＲ区中的位点。由于ＲＮＡ可接近性町能是靶识别的一个关键特征，所以有必要采用Ｚｈａｏ等的方法，采用ｉｎＦｏｌｄ软件测定预测到的ｍｉＲＮＡ结合位点５’端和３’端各７０个核苷酸的自由能（△Ｇ），当△Ｇ低于平均随机自由能时提示此位点允许ｍｉＲＮＡ接近并结合［２”。这些允许ｍｉＲＮＡ接近并结合起来的位点，有必要进一步用实验进行验证。

２ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ间相互作用的结构学验证

２．１

荧光素酶报告载体系统一旦生物信息学方法预测到结

合位点及该位点具有可接近性，ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ间相互作用的功能重要性可以被验证。由于计算方法可能在一个特异靶ｍＲＮＡ上预测到大量的ｍｉＲＮＡ结合位点，因此，有必要用一种快速且可重复的分析来迅速消除不具功能性的相互作用位点。因此，可采用一种报告基因系统来实现这一目的。使用这种分析研究的判定标准是一给定ｍｉＲＮＡ与其特异ｍＲＮＡ靶位点结合后将抑制报告基因蛋白的生成，因此与对照相比，报告基因蛋白表达／活性的减低可以被检测到。实验方法是将感兴趣的靶基因的３１－ＵＴＲ区克隆到报告质粒载体荧光素酶或绿色荧光蛋白开放阅读框序列的下游。必须强调的是，克隆序列必须是全长的３’一ＵＴＲ区，因为此序列的截断到位可能改变预测靶位点的ｍｉＲＮＡ接近性。

ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ策略尽管ｍｉＲＮＡｓ抑制嵌合体报告基因翻

译的能力是一种有用的筛选工具，还是存在检测ｍｉＲＮＡｓ对推测靶基因影响的代替方法。此外，报告载体分析可能导致对基因的错误判定。这是因为转染生理浓度的ｍｉＲＮＡ可能产生一种环境使２种具有互补表面的分子产生非生理的相互作用。最后，在异种背景下３＇－ＵＴＲ序列的表达和被检测也可能发生非生理性的相互作用，这是因为不恰当辅助因子的缘故。因此，经报告载体实验确认的每一个ｍｉＲＮＡ结合位点的有效性需要更直接的实验来验证。一个不用报告载体的实验程序可

２．２

研究进展

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用来验证ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ问的相互作用，这个实验策略分别尽管通常用上述几种方法来验证ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ相互作

由Ｅａｓｏｗ等ｎ¨和Ｂｅｉｔｚｉｎｇｅｒ等［２２１报道。称之为ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ策用，最近研究者报道了另外几种技术。例如，Ｃａｒｅ等合用一种略。这些研究者的实验表明通过使用针对Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）蛋

诱饵靶策略来过表达与小鼠ｍｉＲ—１３３互补序列的３＇－ＵＴＲ区，

自家族成员（这组蛋自已知与ｍｉＲＮＡｓ结合并与特异性靶

此３７一ＵＴＲ序列被克隆在绿色荧光蛋白报告基因的下游。互ｍＲＮＡｓ

３＇－ＵＴＲ区部分互补序列结合）的抗体，可免疫共沉淀

补序列作为一种诱饵可俘获内源的ｍｉＲ－１３３。因此，绿色荧光

Ａｇｏ蛋白结合的ｍＲＮＡｓ。 …… 此处隐藏：7184字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……