生物化学实验指导(最新修改)

实验一 糖的颜色反应

一 实验目的及要求

1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。 3. 掌握杜式(Tollen)试验鉴定酮糖的原理和方法。 二 实验原理

1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。

2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。

3．杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。 三 实验仪器及试剂 仪器：水浴锅。 器皿：吸管、试管。

实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。 实验试剂：

莫式试剂：а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。 杜式试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。临用时配制。 四 实验内容及步骤

一、莫式实验

于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。

二、塞式试验

于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。

三、杜式试验

于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。

五 实验现象记录

仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间

实验二 直接滴定法测定- 葡萄酒、果酒－总糖和还原糖

（参考国标 GB T15038-94）

1 范围

本方法适用于葡萄酒、果酒及其相关产品中总糖和还原糖含量的测定。 2 原理

还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身

被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。

本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2+ Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：

在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：

反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2OFe(CN)6 + 2KOH

滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。 3 试剂

3.1 盐酸溶液（V HCl:H2O 1:1）； 3.2 氢氧化钠溶液200g/L；

3.3 标准葡萄糖溶液2.5g/L：精确称取2.5000g（称准至0.0001g）在105～110℃烘箱内烘干3h并在干燥器中冷却的葡萄糖，用水溶解定容至1000mL。

3.4 次甲基蓝指示液10g/L：称取1.0g次甲基蓝，溶解于水中，稀释至100mL。 3.5 斐林氏A、B 液

a.配制：斐林氏液A：称取分析纯硫酸铜（CuSO4•5H2O）69.28g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，放置1d，过滤，贮于棕色瓶中。斐林氏液B：称取分析纯氢氧化钠100g和分析纯酒石酸钾钠（KNaC4O6H4•4H2O）346g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，放置2d，用石棉垫抽滤。

b.标定预备试验：取斐林氏A、B 液各5.00mL于250mL三角瓶中，加10mL水摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。

正式试验：准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算：

Cu2O + K4Fe(CN)6 + H2OK2Cu2

式中：F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg； C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；

V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。 样品糖的定量测定

(1) 样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。

(2) 样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。 结果处理

其中：m──样品重量，g；

式中：F──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg； V──标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL； V1──还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL； 1000──mg换算成g的系数。 注意事项

（1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

（2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，

氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。

（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 五 还原糖的计算

六 撰写实验报告及实验效果分析

实验三 蛋白质性质（一）——蛋白质及氨基酸的呈色反应

一 实验目的

学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二 实验原理

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应 …… 此处隐藏：9700字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……