第五章 灭菌及无菌空气的制备

发酵的一般流程培养基配制 种子扩大培养 培养基灭菌 空气除菌 发酵设备

发酵生产

下游处理

第五章

灭菌及无菌空气制备

发酵工程无菌技术：– 纯培养发酵技术：发酵全过程只有生产菌，无杂菌

在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：– 杂菌污染使基质或产物被杂菌消耗，造成生产能力下降； – 杂菌产生的某些代谢产物，改变了培养液的理化性质，使提取 精制发生困难； – 杂菌可能会降解目的产物，使得生产过程失败； – 杂菌会污染最终产品； – 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象，使生产失败

为了保证培养过程的正常进行，在接种要培养的微生

物之前，需要进行灭菌与消毒。灭菌对象：培养基；设备与管道；空气系统；流加料、消泡剂;

必要时还有对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体 工业上具体措施包括：– 1)使用的培养基和设备须经灭菌；

– 2)好氧培养中使用的空气应经除菌处理– 3)设备应严密，发酵罐维持正压环境； – 4)培养过程中加入的物料应经过灭菌； – 5)使用无污染的种子。

消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死物料、容器器具

内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法(60℃,30min)。 灭菌(sterilization):用物理或化学方法杀死或除去物料、 空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽

孢和孢子。关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。

常用消毒、灭菌原理与方法 化学药剂消毒：甲醛或新洁尔灭、高锰酸钾等– 使蛋白质凝固变性、酶失活；破坏细胞膜；

物理方法– 辐射灭菌：紫外线、X射线，高能辐射与菌体核酸光化学反应– 干热灭菌法：氧化作用、高温使蛋白质变性和电解质浓缩中毒 – 湿热灭菌法(最常用):蒸汽热使蛋白质变性，大分子氢键收到破坏；

– 过滤介质除菌√:微生物不能透过滤膜而除菌

湿热灭菌法 蒸汽具有强的热穿透力，灭菌易于彻底，效果最好，应用 饱和蒸汽进行灭菌最为普遍。 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例如：实验室内的高压蒸汽灭菌、发酵车间采用的 设备空消和培养基实消。

过滤介质除菌法 过滤介质除菌– 采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过

滤，去除微生物的方法。– 液体：0.22μm或0.45μm滤膜 – 气体：纤维介质滤材捕捉极微小的悬浮微生物 适用范围：对压缩空气制备无菌空气；酶溶液、啤 酒及其他不耐热化合物溶液除

菌。

第一节 培养基和发酵设备的灭菌高压蒸汽灭菌利用饱和蒸汽的高温杀死微生物的同时，高温还可能造成培养基成分的损失。 培养基灭菌的要求： 达到要求的无菌程度 尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：– 培养基中不同营养成分间的相互作用； – 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解

合理选择灭菌条件的关键：了解灭菌温度、时间对微生物死亡和培养基成分破坏的关系。

致死温度：杀死微生物的极限(最低)温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成为致死时间； 在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。

一、培养基的灭菌温度选择用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温度和时间 对微生物死亡和营养成分均有破坏作用，因而选择一种既 能达到灭菌要求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时 间，是研究培养基灭菌质量的重要内容。培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都符合Arrhenius Equation方程:

微生物

反应速度常数增加的倍数

营养成分

K值为比死亡速率

反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。 T相同，k值越小，则微生物越是耐热。 同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小， 温度越高，k值增大。121℃某些细菌芽孢的k值

细菌芽孢名称

k值/min-1

枯草芽孢杆菌FS5230 硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518 硬脂嗜热芽孢杆菌FS617 产气梭状芽孢杆菌PA3679

3.8~2.6 0.77 2.9 1.8

随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。 达到相同灭菌效果时，温度T越高，K值越大(比死亡速率常数),所

需灭菌的时间t 越短。 在实际生产中为了既达到灭菌目的又较好地保存营养成分，最好采用较 高的温度，较短时间进行灭菌，瞬时高温灭菌UHT。即可达到杀死培养

基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。 通常情况选择灭菌温度为121℃,当培养基中含热敏成分，则降低温度微生物 营养成分

芽孢 118℃, 15min 120℃, 1. 5min 99.99% 99.99%

VB2 10% 5%

在确定了培养基灭菌的温度后，如何来计 算灭菌时间？

2.303 No t log k Ntt: 发酵培养基的灭菌时间k: 比死亡速率，min-1,不同微生物在某一温度下的k值差异

N0: 开始灭菌时培养基物料中的活菌数，污染程度Nt: 培养基经灭菌时间t后中的残留活菌数(灭菌程度一般为0.001, 即1000次有一次失败),灭菌程度

在计算灭菌时间过程中需考虑两个问题：一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数

之和作为计 算依据； 二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001,即 1000次灭菌中有一次失败。

二、影响培养基灭菌的其它因素除了灭菌温度和时间外，影响灭菌效果的因素还有： 1.培养基 pH值 ：培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的pH值越低，所需杀 灭微生物的温度越低。pH6.0-8.0时最难灭菌。

pH值对灭菌时间的影响温度 (℃) 孢子数 (个/mL) 灭菌时间(min) pH6.1 pH5.3 pH5.0 pH4.7 pH4.5

120 115 110 100

10000 10000 10000 10000

8 25 70 740

7 25 65 720

5 12 35 180

3 13 30 150

3 13 24 150

影响灭菌效果的因素2、培养基成分： 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物耐热性；– 大肠杆菌E.coli在水中加热60-65℃死亡；在10%糖溶液中，需要

70℃加热4~6min,在30%糖溶液中，需要加热30min。 另一些物质，如高浓度的盐类、色素等的存在等可削弱其耐热性

3、泡沫： 对灭菌极为不利，泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿 透。在易产生泡沫的培养基中加入消泡剂。