培养细胞的免疫荧光

培养细胞的免疫荧光

1．将培养液弃去（尽量吸干），用PBS洗一遍（24孔板每孔用0.3-0.5ml PBS，固定前有些细胞贴壁不牢，尤其是有一定cluster结构的区域容易脱落，所以需要注意稍轻缓）；2．弃去PBS（尽量吸干），加入适量（24孔板每孔用0.2-0.3ml）4%多聚甲醛固定液（一般4C放置），室温固定15分钟；

3．弃去固定液（尽量吸干），用PBS洗1-2次（24孔板每孔用0.3-0.5ml PBS，同上）；4．弃去PBS（尽量吸干），加入适量抗体封闭液（5-10%驴血清，0-0.3% Triton X-100，PBS 配制；24孔板每孔用0.2ml保证全部覆盖住即可），室温1-2小时（也可4C过夜，或者37C 30分钟-1小时）；

5．弃去抗体封闭液，加入适量一抗溶液（稀释于上述抗体封闭液中；24孔板每孔用

0.15-0.2ml保证全部覆盖住即可），4℃过夜孵育（也可室温/37C若干小时）；

6．用PBS洗三次，每次3-5分钟；

7．弃去PBS（尽量吸干），加入适量二抗溶液（稀释于上述抗体封闭液中；一般1：200稀释，Jackson公司的Donkey来源的IgG），室温孵育1-2小时；

8．用PBS洗三次，每次3-5分钟；

9．用DAPI 复染，室温3-10分钟；

10．弃去DAPI溶液，PBS洗2-3次；

11．显微镜下观察，拍照（非相差显微镜下）。

注意事项：

1.孵育时间并非固定不变。一般情况下4C染的话背景较少，但所需时间长；37C或室温

染背景相对较高，但迅速。

2.抗体质量非常重要，需要根据不同抗体的不同性能予以适当调整（Jackson二抗经过测

试，1：200室温1-2小时效果很好）。

3.注意一、二抗的搭配，选择合适的组合。

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