血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

EXPERIMENT 5

血清蛋白醋酸纤 维素薄膜电泳

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质的原理和 方法。

实验目的支持介质

醋酸纤维素是把纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素 醋酸酯,将其涂布得到的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种 薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中 出现的“拖尾”现象；膜的亲水性比较小，它所容纳的 缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，分离速 度快，电泳时间短；样品用量少，5μg的蛋白质可得到 满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常 蛋白的检测。 醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处 理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定 和膜的长期保存。

实验原理蛋白质名称白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 等电点(pI) 4.8 5.06 5.06 5.12 6.85-7.3

相对分子质量69000 200000 300000 90000-150000 156000-300000

本实验是以醋酸纤维素薄膜为支持物的区带电泳。在 PH8.6的缓冲液中，各蛋白均带负电荷，在电场中向正极 泳动。由于血清中不同蛋白质所带的电荷数量及分子量不 同，因此泳动速度不同，从而彼此分离。电泳薄膜经染色 和漂洗，可清晰呈现五条区带！经洗脱比色或者薄膜经透 明处理后扫描可以测定各蛋白组分的相应百分含量。

操作

点样将醋酸纤维素薄膜小条浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中， 使之完全浸泡透。 将浸泡的薄膜取出，用滤纸吸去多余的水分，让薄膜的 无光泽面向上，用有机玻片末端蘸取少量血清在距一末端 1.5cm处点样。

电泳将点样的薄膜无光泽面向下，置于电泳槽支架上，点样 端置于负极。槽架上用4层滤纸做桥垫，膜条与滤纸必须贴 紧，平衡5min后通电，电压110v电泳1h。

染色电泳结束后，用镊子将膜取出，直接浸于氨基黑10B中染1min,后置于漂洗液中反复漂洗至背景干 净为止。用滤纸吸干薄膜。

结果观察一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区

带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2 球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。

临床意义人血清中五种蛋白质的正常范围： 清蛋白 57-72%; α1球蛋白2-5%; α2球蛋白4-9%; β球蛋白 6.5-12%; γ球蛋白 12-20%。

肝硬化时清蛋白含量减少，γ球蛋白明显升高； 肾病综合症清蛋白含量减少，α2球蛋白和β球 蛋白升高。

EXPERIMENT 6

血清脂蛋白琼脂 糖凝胶电泳

实验目的

掌握血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理和方法

支持介质琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及 其

它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网 孔型凝胶。对一般蛋白质不起分子筛作用。该凝胶适合于 蛋白质、核酸的分离、纯化及鉴定。并广泛用于免疫电泳 技术。 优点：近似自由界面电泳，速度快；电泳后区带整齐，分辨 率高，重复性好；便于紫外监测及定量测定。

实验原理血清中含有多种脂蛋白，不同脂蛋白由于其脂类和 蛋白质的组成、含量及比例不同，颗粒大小不一，故在 同一电场作用下泳动速度不等，从而可以分离。本实验 以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预 染，使血清脂蛋白着色，然后将预染过的血清置于琼脂 糖凝胶板上进行电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解， 冷却后比色，或者用光密度计直接扫描。计算出α脂蛋 白、β脂蛋白和前β脂蛋白的相对百分数。

实验试剂

巴比妥-HCl缓冲液(pH=8.6,离子强度0.075)称取巴比妥钠15.5 g,量取1mol/L HCl 12 ml,加蒸 馏水至1 000 ml。此为电极缓冲液。

巴比妥-HCl缓冲液(pH=8.6,离子强度0.05)称取巴比妥钠10.3 g,量取1 mol/L HCl 18 ml,加 蒸馏水至1 000 ml。用于配制琼脂糖凝胶。

0.8%琼脂糖凝胶 1%苏丹黑B的石油醚-乙醇(1 :4,V/V)溶液

操作1、预染血清吸取血清0.2ml于一小试管中，加入苏丹黑B染色液 0.02ml及无水乙醇0.01ml,混匀后置于37℃水浴中预染 30min。离心(2000r/min) 5min以去掉多余染料颗粒。

2、琼脂糖凝胶板的制备将0.8%的琼脂糖煮沸溶解后，用刻度吸管吸取凝 胶溶液注于载玻片上，每片约注液3ml,趁热将盖槽用 的“Π”形有机玻璃盖在距载玻片一侧约1 cm处 。

3、点样将已凝固凝胶上的“Π”形有机玻璃轻轻取下，凝胶上便 显示出小槽。用小滤纸片吸干槽中水分，用微量加样器(或 血色素吸管)吸取预染血清40μl,注入小槽中。

4、电泳将点样的凝胶板放于电泳槽架上，样品放于负极端，用4 层在电极缓冲液中浸泡过的滤纸搭桥，滤纸的一端接在凝胶 板的一端，另一端与缓冲液连接。120~150V,电泳45min。

5、定量洗脱法：切下凝胶板各脂蛋白色带，分别置于盛有3ml蒸 馏水的试管中，另在空白区切一同样大小的凝胶作为空白管。 各管置于沸水浴中3min,使凝胶溶解。冷却后在660nm处比 色，记录光密度。计算各部分脂蛋白的百分数。

实验结果

血液中的脂类除游离脂肪酸 与白蛋白结合外，其余均与 球蛋白结合成为脂蛋白，各 种脂蛋白因其所含的脂类及 蛋白质的量不同而不同。

临床意义血清中一种或一种以上脂蛋白含量增高称为高脂 蛋白血症，可分为以下五型： Ⅰ型：出现乳糜微粒； Ⅱa型：β脂蛋白含量升高

; Ⅱb型：β脂蛋白含量升高并伴有前β脂蛋白升高； Ⅲ型：出现异常的宽β脂蛋白区带； Ⅳ型：前β脂蛋白含量升高； Ⅴ型：前β脂蛋白含量升高并出现乳糜微粒； Ⅱ和Ⅴ型最为常见。

讨论

比较LDH同工酶电泳、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 和血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的染色有什么不同？ 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳有什么临床意义？ 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳有什么临床意义？