基因工程习题与答案(4)

以12°C一15°C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。

另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E．coli DNA连接酶具有激活作用。E．coli DNA 连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4 DNA连接酶需要ATP。

4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?

Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片

段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。

Klenow酶主要有下列用途：

(1)修复反应，制备平末端

可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样

可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。

用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；

而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。

(2) 标记DNA3'突出末端(protruding end)

该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在

高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。

(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、

在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。

5．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?

主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：

(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，

再进行连接反应。

(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。

6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?

外切核酸酶是从 噬菌体感染的E．coli中分离纯化的，能够从双链DNA上依次切下5'单核苷酸，作用底物是双链DNA的5'磷酸末端，不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链DNA,但效率较低(下降200倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5'末端，以便让末端转移酶加尾。

7．Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响?Dnase I在基因工程中有

什么作用?

DNase I是一种内切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I随机切割DNA两条链中的任意一条链；

当Mn2+代替Mg2+时，DNase I几乎是在双链DNA两条链相对的位置上打开缺口，使双链DNA断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出1～2个核苷酸的DNA片段。

DNase I有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护DNA；

(3)除去RNA制备物中的DNA；(4)体外转录中除去DNA模板；(5)检测染色体中的转录活性

区；(6)产生可在噬菌体M13载体上进行测序的随机克隆。

8．质粒如何维持在细胞中的稳定？

质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定：

(1)多聚体质粒的分解

如果质粒在复制时形成多聚体的话，在细胞分裂过程中质粒丢失的可能性就会增加。一个多聚体是由多个单体相互连接而成的。多聚体的形成可能是由于在复制终止时发生错误或者是由于单体间重组的结果。由于多聚体在细胞分裂时将作为一个质粒进入一个子细胞，这样，多聚体的形成就大大降低了质粒的有效拷贝数，因此，多聚体也就大大增加了细胞分裂时质粒丢失的机会。为了避免这种情况的发生，很多质粒都具有位点专一性重组的系统，可以破坏多聚体。

(2)分离(partitioning)

质粒通过一种分离系统来防止在细胞分裂过程中质粒的丢失，这种机制保证在细胞分裂过程中每个子细胞至少可得到一个质粒拷贝，这是由称为par功能(Par functions)完成的。 所谓par功能是指某些质粒，包括F、R1等质粒上具有的一些短的区域，这些区域能够增强质粒拷贝的合适分配。如果从质粒中将这种区域拿掉，质粒丢失的频率就会相当高。已经深入研究过P1质粒的分离系统，发现P1质粒的分离系统由一个顺式激活par序列和两个蛋白ParA和，ParB的基因构成，其中一个蛋白同par位点结合。

关于par位点是怎样增强质粒适当分离的机制有两种模型，按照这两种模型，细菌的膜具有真核生物有丝分裂纺锤体的功能，在细胞分裂之前将质粒分开。par位点是质粒同质膜结合的区域，在细胞分裂时，由于膜的生长，质粒的两个拷贝就被拉到两个子细胞中。这两个模型对于细胞分裂时，质粒同质膜的结合是怎样保证每个细胞至少得到一个质粒的解释是不同的。

模型．A：par位点同细菌质膜的一个假定位点结合。在这个模型中，每一种质粒都有它自己独特的同质膜结合的位点。当细胞生长时，位点也加倍，每一个质粒拷贝结合一个位点。由于这些位点随着细胞分裂而分开，每一个质粒拷贝将分配到一个子细胞。这就保证了质粒不会丢失。该模型要解决的问题是质膜上必须有许多独特的位点以供不同的质粒拷贝结合，这似乎不太可能。

将模型A稍微改动一下，就可以满足质粒分离所需的位点。如果我们假定质粒结合的位点不在质膜而是在细菌的染色体上就可以了。染色体上有很多的位点，并且随着DNA的复制而加倍，这些位点可供质粒结合。剩下的唯一问题就是在质膜上有同染色体结合的独特位点，这样，质粒将随着染色体的分离而分离。