PTEN、VEGF和MMP2在胃癌组织中的表达及其与胃癌浸润、转移和预后(3)

本研究采用免疫组化ＳＰ技术检测８０例胃癌组织中ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ和ＭＭＰ２表达，同时检测２０例正常胃组织中ＰＴＥＮ表达，明确ＰＴＥＮ在胃癌和正常胃组织中的表达

差异，明确胃癌组织中ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ和ＭＭＰ２表达间的关系及其与胃癌临床和生物

学行为间的关系，探讨胃癌组织中ＰＴＥＮ的表达特点，ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ和ＭＭＰ２表达与胃癌浸润、转移和预后的关系及其可能的作用机制。

２材料与方法

２．１研究对象

选取安徽医科大学第一附属医院普外科１９９５．卜１９９８．６间行根治性手术治疗患者，术后随访，随访以信访为主，结合电话随访，随访截止日期２００３．６．３０。

选取临床、病理和随访资料齐全的胃癌患者８０例。其中男６１例，女１９例，男女之比３．２１：１；年龄２８岁一７７岁，平均５６．０５岁－－＋９．８１岁，其中＜６０岁

４７／８０（５８．８％），≥６０岁３３／８０（４１．３％）；肿瘤直径３．６４ｃｍ＋１．６７ｃｍ，其中＜３．０ｃｍ４１／８０（５１．３％），＞／３．０ｃｍ３９／８０（４８．８％）；肿瘤部位：贲门胃底、胃体、胃窦

分别为２７／８０（３３．８％）、２５／８０（３１．３％）、２８／８０（３５．Ｏ％）；胃癌分化程度：高、中分化３１／８０（３８．８％）、低分化或未分化４９／８０（６１．３％）；肿瘤生长方式：非浸润性生长

４４／８０（５５．０％）、浸润性生长３６／８０（４５．０％）；浸润深度：粘膜或粘膜下层１９／８０（２３，８％）、肌层或浆膜层６１／８０（７６．３％）；淋巴结转移：无淋巴结转移５１／８０（６３．８％）、有淋巴结转移２９／８０（３６．３％）；远处转移：根据国际抗癌联Ｎ（ＵＩＣＣ）分期标准（第４版），将伴有远隔脏器转移和１２～１６组淋巴结转移者定位远处转移，

其中无远处转移６１／８０（７６．３％）、有远处转移１９／８０（２３．８％）：肿瘤分期：采用国际抗癌联盟（ＵＩＣＣ）分期标准（第４版），

Ｉａ期１４例、Ｉ

ｂ２４例、ＩＩｌ９例、ＩＩｉａ２２

例、Ｗ１例，其中Ｉ、ＩＩ期５７／８０（７１．３％、，ＩＩＩ、Ⅳ期２３／８０（２８．８％）；手术方式：近

安徽医科大学硕士学位论文

端胃癌根治术、远端胃癌根治术、根治性全胃切除术、联合脏器切除术分别为：９／８０（１１．３％）、４０／８０（５０．Ｏ％）、３０／８０（３７．５％）、１／８０（１．３％）；淋巴结清扫范围：Ｄ。

１／８０（１．３％）、Ｄ，１／８０（１．３％）、Ｄ。７４／８０（９２．５％）、Ｄ３４／８０（５．ｏ％）：术后３年生存率

５６／８０（７０．０％），５年生存率３８／８０（４７．５％），中位生存时间４２．４月±１６．４月。

另选取２０例同期经胃镜及病理诊断为正常胃粘膜组织作对照组，其中男性１３例，女性７例，年龄２８岁～６２岁，平均５２．２２岁±８．４４岁。２．２实验材料２．２．１仪器

Ｌａｉｃａ

２１３５型原装石蜡切片机（德国Ｎｕｓｓｌｏｃｈ公司）

病理切片漂烘仪ＱＰ—Ｂｌ型（安徽电子科技研究所）

可调温烤箱ＤＨＰ０６０型（上海实验仪器厂）

４℃冰箱（海尔冰箱厂）

光学显微镜１０２型（日本Ｎｉｋｏｎ公司）

Ｏｌｙｍｐｕｓ荧光显微镜ＢＸ６０Ｆ５型配全自动照相装置ＰＭ２０－－３５型（日本ＯＬＹＭＰＵＳ

公司）

ＰＨ酸度计ＰＨｓ一２５型（上海雷磁仪器厂）

医用微波炉ＷＰ７００型（上海中达医学应用研究所）

微量移液器ＱＵＹＥＱｌ、孵育盒ＢＯＸ－－０００１、实验冲洗瓶ＷＡＳ－－１００１、不锈钢高

压锅ＨＹＧ～１００１、耐高温塑料片架ＰＳＪ—ｌＯＯｌ，均为福州迈新公司产品。

２．２．２试剂

即用型ＰＴＥＮ鼠抗人单克隆抗体，购于福州迈新生物技术开发公司。

浓缩型ＶＥＧＦ兔抗人多克隆抗体，工作浓度１：２００，购自武汉博士德生物技

术有限公司。

浓缩型ＭＭＰ２兔抗人多克隆抗体，工作浓度１：２００，购自武汉博士德生物技

术有限公司。

即用型ＳＰ免疫组织化学染色试剂盒，（通用型）购于福州迈新生物技术开发

公司。

安徽医科大学硕士学位论文

二氨基联苯胺四盐酸盐（Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＤＡＢ），购于福州迈新生物技术

开发公司。

２．３实验原理

免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，

ＳＰ）法，其基本原理为：一抗与组织切片中的抗原结合后，用生物素标记的二抗

与一抗结合，再使用链霉菌抗生物素蛋白（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）一过氧化物酶

（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）放大系统产生低背景、高放大效果，ＤＡＢ被酶分解后显色来测定组织细胞中的抗原。Ｓ－－Ｐ法比ＡＢＣ法等具有特异性更强、背景更清晰、节省抗体等优

点，是目前免疫组化技术中最具优越性的染色方法。见图１。

６

ＥＮＺ：过氧化酶或磷酸鲜

图１免疫组化ｓＰ法原理示意图

ＦｉｇｕｒｅｌＲａｔｉｏｎａｌｅｏｆＳＰｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ

２．４实验方法和步骤

全部标本１０％甲醛固定，常规石蜡包埋，连续４

ｕ

ｍ切片，采用免疫组化

ＳＰ技术检测标本中ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ和ＭＭＰ２表达。对于不同组织、不同检测指标，

１０

窒竺垦塾查兰壁圭兰焦垒查

免疫组化ＳＰ法的各步骤均有可调性，如抗原修复方法、抗原修复液的选择、

各步骤反应时间、反应温度等。为了更好地观察各指标的表达情况，本实验通过多次预实验对上述条件进行了优化，具体步骤如下：

一

（１）于６０。Ｃ恒温箱中烤片５—８小时。

（２）二甲苯及梯度酒精脱腊、水化，二甲苯３次，每次５分钟（５’×３，下同），

无水酒精５７×２，９５％酒精５７×１，９０％酒精５７×１，７５％酒精５’×１，蒸馏水冲洗。

（３）ＰＴＥＮ采用高温高压抗原修复：将脱腊水化后的组织切片放置在耐高温塑

料切片架上，置于沸腾的柠檬酸盐缓冲液中（０．０１Ｍ，ＰＨ６．０＋０．０１），加盖扣阀，达工作温度和压力２分钟后，压力锅离开热源，１分钟后自来

水冲淋冷却，去阀开盖，取出玻片，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗三次，每次５分钟

（５’×３，下同）。

（４）每张切片加５０ｕ１３％Ｈ：伤（Ａ液），室温（或３７。Ｃ温箱中）孵育１５’，阻断

内原性过氧化物酶活性，ＰＢＳ冲洗５’ｘ３。

（５）每张切片加非免疫性动物血清（Ｂ液）５０儿ｌ，室温孵育ｌＯ分钟。（６）甩去多余液体，每张切片加第一抗体５０ｐｌ，４。Ｃ过夜。（７）ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗５’×３。

（８）甩去ＰＢＳ液，每张切片加通用型生物素标记羊抗兔、抗鼠ＩｇＧ（Ｃ液）５０ｕ－１，

室温孵育１５分钟，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗５’Ｘ３。

（９）甩去ＰＢＳ液，每张切片加新鲜过氧化物酶标记链亲和素（Ｄ液）５０¨ｌ，室

温孵育１５分钟，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗５’×３。

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