鸡传染性腔上囊病卵黄抗体制备工艺中最佳沉降脱脂条件的确定

中国兽医科技 第32卷 第2期 2002年25

鸡传染性腔上囊病卵黄抗体制备工艺中最佳沉降

脱脂条件的确定

谢秀气,王中来,魏岩梅,饶平凡

(福州大学2生物工程研究所,福建福州 350002)

摘要:采用沉降脱脂分离技术,从鸡超免疫卵黄中提取传染性腔上囊病卵黄抗体免疫球蛋白(IgY)。通过正交试验,确定乙酸乙酸钠缓冲液为最佳沉降脱脂缓冲液。用pH值为5.2,浓度为0.12mol L的乙酸9倍稀释卵黄液,在约300r min下搅拌10min后,置于4 下沉降34h,沉降上清液中IgY含量占卵黄中蛋白总量的25%左右,脱脂率>98%,活性损失可忽略不计。

关键词:传染性腔上囊病;卵黄抗体;沉降脱脂

中图分类号:TQ369.21;S859 文献标识码:A 文章编号:10006419(2002)02002502

传染性腔上囊病(IBD)是一种急性高度接触性传染病,是由双链核糖核酸病毒(IBDV)引起的,能引起雏鸡免疫抑制,破坏腔上囊中B淋巴细胞的形成,临床上以腔上囊肿大、肾损害为主要特征

[1]

酸及乙酸乙酸钠)、缓冲体系pH值(3.65.8)、缓冲液浓度(0.010.10mol L)和搅拌时间(约300r min下搅拌,10 202min)。

1.4 脱脂工艺条件的初选 经试验确定乙酸佳缓冲体系后,再选用L9(34)正交表进行3个因素的正交试验。这3个因素分别为pH值(4.85.8)、缓冲液浓度(0.010.102mol L)和搅拌时间(10202min)。

1.5 脱脂工艺条件的优化 最优工艺条件确定试验,也是采用L9(34)进行正交试验。试验设计的3个因素分别为缓冲液pH值(5.05.2)、缓冲液浓度(0.080.122mol L)和搅拌时间(5152min)。

1.6 沉降速度测定与比较 在42 条件下进行沉降试验,按照一定的时间间隔记录沉降高度。然后将本试验最优工艺条件下的沉降速度与目前文献所报道的最佳工艺条件下的沉降速度进行比较,并且用水代替缓冲液作参照。文献报道的最佳工艺条件是pH值为6.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲体系(其中磷酸氢二钠浓度为0.04mol L)[7]。

1.7 效价测定 采用双向琼脂扩散法[8]测定卵黄、上清液及沉渣的效价。

1.8 脱脂率与蛋白质回收率的测定 蛋白质回收率的测定采用Folin[8],而脂肪含量的测定采用香草醛显色法[9]。2 结果与讨论

2.1 缓冲体系的选择 由正交试验结果可知,缓冲液浓度越高,沉降效果越好,卵黄液的沉渣越结实;同一浓度下,乙酸乙酸钠缓冲液所处理的卵黄液沉降速度比另外两种缓冲液明显加快;对于乙酸乙酸钠缓冲液,pH值在4.85.8之间的效果较佳。此外9份卵黄液沉降1d后,有些样品仍无法取样分析,所以在这一轮正交试验设计中无法进行方差分析或极差分析,只能进行定性分析。

2.2 脱脂工艺条件的初选 由正交试验结果可知,缓冲液pH值在5.2时,沉降效果最佳;缓冲液浓度越高,沉降所得的上清液越清;而搅拌时间对沉降效果的影响不大,可定在5152min的范围内。由于个别卵黄液的沉降效果太差,无法取得上清液的,,。雏鸡或中雏易感性最强,感染率可达100%,死

亡率比较高,严重影响养鸡业的发展。近年来,利用免疫技术控制鸡IBD取得了一定效果。但是,一旦IBD发生,迄今为止尚无特效药物治疗。然而,免疫或康复鸡血清以及超免疫卵黄抗体对刚出现症状的鸡有良好的治疗效果[2]。

鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备成本只相当于动物血清中的免疫球蛋白(IgG)的数十分之一到几百分之一[3]。早在20世纪60年代,科学家们就发现鸡卵黄中存在IgY抗体

[4]

,其含量

与鸡血清相似,甚至更高,但一直未引起足够的重视。这显然是由于很难将IgY抗体从卵黄脂质中分离出来的缘故。直到20世纪80年代初一些学者相继建立了聚乙二醇(PEG)提取法

[5]

和硫酸葡聚糖提取法[6]后,IgY抗体才能从丰富的卵黄脂质中分离出来。然而这些方法普遍存在步骤多、批量少、试剂耗量大和设备投资高等问题[3]。本研究旨在利用正交试验设计,确定IBD卵黄抗体制备工艺中最佳沉降脱脂条件。1 材料与方法

1.1 试剂与材料 试验用试剂主要包括含IBDV抗体的新鲜鸡蛋、琼脂粉(中国医药上海化学试剂公司产);鸡IBD阳性血清和鸡IBD琼脂扩散抗原(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所产)。

1.2 试验流程 卵黄沉降脱脂的流程为:母鸡免疫(用IBDV疫苗) 鸡蛋(含IBDV抗体) 卵黄 缓冲液稀释、沉降(正交试验) 上清液 过滤(添加硅藻土作助滤剂) 超滤 冷冻干燥 IgY产品(粉末状)。

1.3 缓冲体系的选择 用正交表L9(34)进行正交试验。试验设计的4个因素分别为缓冲液种类(柠檬酸磷酸氢二钠、柠檬

收稿日期:200108

27

基金项目:福建省自然科学基金(C0010005)和福州大学科技发展

基金资助项目

:

26ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnology Vol.32 No.2 2002

2.6 脱脂率与蛋白回收率的测定 在本研究所确定的最佳沉降工艺条件下,经香草醛显色法检测,脱脂率可达到98.0%以上。而经Folin酚法检测,沉降后上清液中的IgY约占卵黄蛋白总量的25.5%,说明采用乙酸乙酸钠缓冲体系进行卵黄水溶成分的分离时,IgY回收率比较高。3 结语

3.1 本研究确定,从鸡卵黄中分离提纯抗鸡传染性腔上囊病的特异性卵黄抗体IgY的最佳沉降脱脂条件为:乙酸乙酸钠缓冲液的pH值为5.2,浓度为0.122mol L,搅拌溶解时间为102min,沉降时间为342h。

3.2 在最佳沉降脱脂条件下,脱脂率达98.0%以上,活性损失可忽略不计;而采用Folin酚法所测得的蛋白回收率为25.5%。3.3 本研究经过正交试验设计所优化出的试验条件,明显优于文献中所报道的最佳沉降脱脂条件(柠檬酸磷酸氢二钠缓冲体系),主要体现在沉降速度快得多。

3.4 本工艺具有制备步骤少、操作简便、投资少和便于规模化生产等优点。参考文献:

[1] 王明俊.兽医生物制品学[M].北京:中国农业出版社,

1997.647648.

[2] 贾冬舒,陈巍,祝下菊.杀痢停注射液对鸡传染性炎病的

治疗试验[J].农业与技术,1999,19(4):8182.

[3] 傅蓉,李珑,王中来,等.鸡卵黄免疫球蛋白的嗜硫性色谱

一步分离纯化[J].福州大学学报(自然科学版),2000,28(6):111114.

[4] CarrollSB,StollarBD.AntibodiestocalfthymusRNA

polymerase!fromeggyolkofimmunizedhens[J].JBiolChem,1983,258:24.

[5] StuartDA.Highaffinityantibodyfromhenseggsdirected

againstthehumaninsulinreceptorandthehumanIGF 1re ceptor[J].AnalyticalBiochemistry,1988,173:142.[6] GottsteinB,HemmelerE.EggyolkimmunoglobulinYasan

alternativeantibodyinserologyofechinococcosis[J].ZPar asitenkd,1985,71:273.

图1 沉降速度曲线

[7] LiLong,WangZhonglai,ZhouJianwu,etal.Improved

methodsfortheseparationandpurficatinofimmunoglo bulinfromeggyolkbyfiltrationandthiophilicchromatog raph[A].242251.

[8] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术[M].第2

版.北京:高等教育出版社,1997.137138,353354.[9] 王继贵.临床生化检验方法[M].长沙:湖南科学技术出

版社,1996.337338.

Foodof21stcenturyfoodandresource

technologyenvironment[C],无锡:轻工业出版社,2000.

交试验设计中也只能进行定性分析。

2.3 脱脂工艺条件的优化 由探索性正交试验结果可知,缓冲液pH值与浓度对沉降效果的影响是显著的,并且pH值为5.0和浓度为0.052mol L时效果较好,而搅拌时间对沉降效果的影响很小。但是 …… 此处隐藏：3082字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……