中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法(5)

中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

6.5.2 滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。

6.5.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。

6.5.4 滴加95%乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。

6.5.5 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。

6.5.6 染色结果

革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。

大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。

6.5.7 注意事项

6.5.7.1 玻片必须洁净，无划痕。涂片的菌量宜少，菌液不可过浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断，不利菌细胞的形态观察。

如菌液过浓，须再取洁净载玻片进一步稀释。

6.5.7.2 培养物的菌龄以16～24h为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。

6.5.7.3 脱色是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。 7 生化试验

7.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。

为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5％乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。

7.2 靛基质试验（Ⅰ） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98％的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作靛基质试验。

7.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

7.4 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P） 取上述斜面培养物。接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。

7.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，