中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法(3)

10 检查法

10.1 平皿法

10.1.1 在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注2～3个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。

10.1.2 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。

10.1.3 倾注培养基

将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂培养基（酵母菌）熔化，冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，盖上陶瓦盖，或半盖盖，除去冷凝水后，再移去陶瓦盖后，盖上平皿盖置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。

10.1.4 培养

细菌计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于23～28℃培养箱中培养5天，必要时延长至7天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。

10.1.5 菌落计数

10.1.5.1 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间，以及菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。

10.1.5.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数

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内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。

10.1.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相区别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿）。注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中。在计数菌落时作为对照。或用含TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用含TTC营养琼脂注皿。TTC的用量应以不抑制微生物生长为宜，通常使用的浓度为0.001％。

10.1.5.4 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界线，一条链、片作为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链、片状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。

10.1.5.5 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌需在24h，霉菌需在48h做初步点计（点计霉菌菌落时，轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。

10.1.5.6 在培养3天点计细菌，培养5天点计霉菌时，如菌落极小，不易辨认，细菌计数可延长培养时间至5天；霉菌及酵母菌计数可延长培养时间至7天，再点计菌落数。

10.1.5.7 对有异议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。

10.1.5.8 含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YPD琼脂培养基点计酵母菌数。两者合并计数。

10.1.5.9 在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数多的培养基中的菌数为计数结果。

10.1.6 菌数报告规则

10.1.6.1 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌菌落数平均数小于100cfu的平板计数作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

10.1.6.2 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数；当有2个或2个以上稀释剂的菌落数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数值的值报告。

10.1.6.3 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均茵落数小

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于1时，以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。

菌数报告规则示例见下表2。

表2 菌数报告规则示例

10.2 薄膜过滤法

10.2.1 薄膜过滤法主要起到富集微生物、分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素的作用，可以有效提高检查结果的灵敏度和可靠性，是近年来微生物检查领域中日益广泛应用的一种技术手段。

10.2.2 薄膜过滤法采用的滤膜孔径应不大于0.45um。滤膜直径一般为50mm，为便于计数，以及减轻供试液堵塞滤膜的情况，在便于操作的前提下，可以选用直径更大的滤膜或薄膜过滤器。采用不同直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

10.2.3 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，以滤膜直径为50mm的滤膜计，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml；其他直径的滤膜及薄膜过滤器可按膜面积比例调整，总的原则是避免大体积、过高流速的冲洗造成滤膜上的微生物受损伤。

10.2.4 由于供试液中一些不能通过滤膜的颗粒存在，常常造成滤膜堵塞、压力升高，严重情况时可能发生过滤装置炸裂造成安全事故或实验室污染；也可能发生由于压力过大滤膜开裂或滤膜孔径变大，造成滤膜对微生物的过滤截留失败。所以，实际操作中应考虑对薄膜过滤中的压力控制和设备的安全性，设置一定的安全压力限度，例如滤膜两侧压差不得过50psi。具体压力限度应根据具体薄膜过滤装置及滤膜确定。

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10.2.5 采用适当方法去除供试液中的颗粒（前提是不能影响微生物的回收率）、适当增加薄膜面积或降低过滤液体流速可以有效降低滤膜两侧的压力差。

10.2.6 取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g、1ml或10cm所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量见10.2.3及10.2.4。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰 …… 此处隐藏：2939字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……