中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法(2)

7 供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。所用乳化剂，分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间不得超过30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：

7.1 液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

7.2 固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

7.3 非水溶性供试品

7.3.1 软膏、乳膏剂 取供试品5g（或5m1），加至含溶化的（温度不超过45℃）司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌混合物（溶化，温度不超过45℃）的烧杯中，即先将烧杯中无菌助溶剂混合物溶化，待温度不超过45℃时，加入供试品，用无菌玻棒搅拌成团后，分次慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。

7.3.2 油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 5～8ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml，作为1:10供试液。

7.3.3 栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水浴保温10min，使溶，

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加入无菌聚山梨酯80 5～8ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100m1），摇匀，作为1:10供试液。

7.3.4 膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录Ⅺ H“无菌检查法”)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液100m1，振摇5～10min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。

7.4 非水溶性膜剂供试品 一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液，于45℃±1℃水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为l:10供试液。中药膜剂取100cm2，剪碎，加适量的pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液（通常1 cm2加1ml或2m1），浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10供试液。

7．5 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10供试液。

7.6 气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰箱冰冻室（－20℃以下）内约1h。取出，迅速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的稀释剂（若含非水溶性成份，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。

7.7 茶剂供试品 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇2～3min，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1:10加稀释剂，浸泡30min）。

以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂的量，制成1:20～1:100供试液。

7.8 贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30min，或放置于均质仪均质l0min，或以其他方法制备成供试液。

7.9 具抑菌活性的供试品

当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：

7.9.1 稀释法 取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。

7.9.2 离心沉淀法 此方法用于去除供试液中的沉淀物，对于抑菌活性较强的供试品，如供试液中有不溶颗粒、沉淀，取供试液，先以500 r／min，离心3min，取上清液进行试验，此方法用于细菌计

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数和控制菌（细菌）检查。

7.9.3 薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌计数。

7.9.4 中和法 凡含汞、砷或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。

8 供试液的释稀（10倍递增稀释法）

8.1 取2～3支灭菌试管，分别加入9ml pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在酒精灯火焰的正上方操作，以免火焰将供试液中的菌细胞杀灭）。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。

8.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml，加入装有9ml pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得1:100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:10、1:104等适宜稀释级。每递增l稀释级，必须另换一支吸管。

稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。

9 计数方法验证

由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

9.1 验证用菌株大肠埃希菌Escherichia coli [CMCC(B) 44102]，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus [CCMCC(B) 26003]，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis [CMCC(B) 63501]，白色念珠菌Candida albicans

[CMCC(F) 98001]，黑曲霉菌Aspergillus niger [CMCC(F) 98003]。

菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48h。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml／ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。

菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。

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黑曲霉菌的孢子悬液保存在2～8℃，可在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。

9.2 验证方法 验证试验分4组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。