酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

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2010No．9SerialNo．222

ChinaBrewing

ResearchReport

酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

包伟霞，王静洁，王晓斐，陈由强，许旭萍*

（农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室福建师范大学生命科学学院，福建福州350108）

摘要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）和马克斯克鲁维酵母菌

（Kluyveromycesmarxianus）原生质体形成与再生的影响。实验结果表明，原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h，采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解70min；马克斯克鲁维酵母菌龄8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min；配制酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液，在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。关键

词：酿酒酵母；马克斯克鲁维酵母；原生质体的形成与再生

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2010）09-0042-03

中图分类号：TS261.1

ProtoplastformationandregenerationofSaccharomycescerevisiaeandKluyveromycesmarxianus

BAOWeixia,WANGJingjie,WANGXiaofei,CHENYouqiang,XUXuping*

(KeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement,MinistryofAgriculture;

CollegeofLifeSciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou,350108,China)

Abstract：Effectsofhyphaage,enzymeconcentration,stabilizerforosmoticpressureandenzymeolysistimeontheprotoplastformationandregenera-tionofSaccharomycescerevisiaeandKluyveromycesmarxianuswerestudied.Theoptimumconditionsforprotoplastformationandregenerationwereasfollows:S.cerevisiaeagedat9h,hydrolysiswith1.5%snailaseand0.5%cellulaseunder30℃for70min;K.marxianusagedat8h,hydrol-ysiswith1.0%snailaseand0.5%cellulaseunder30℃for50min;4%NaC1forstabilizationofosmoticpressureinpreparationofenzymolysissolu-tion，and15%canesugarsolutionfordilutionandmediumofregenerationculture.Keywords：Saccharomycescerevisiae;Kluyveromycesmarxianus;protoplastformationandregeneration

原生质体融合技术具有杂交频率高、重组种类多、遗传信息传递量大等优点，目前已广泛应用于微生物菌种的酿酒酵母Y01是一株具有良好发酵性能[1]，能够利改良中。

用甘蔗汁发酵生产酒精的优良菌株，但其最适生长温度为30℃，最适发酵温度为32℃，不能适应高温酒精发酵；而马克斯克鲁维酵母Y05具有较强的耐热性，在40℃时仍能为了得到一株既耐高温又高正常生长，但是产酒率较低。产酒精的新型酵母菌株，拟采用原生质体融合技术对酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母进行杂交。原生质体的制备与再生是融合前提，据文献报道，酵母菌原生质体的再生较为困难，再生率较低[2-3]。为了克服这一问题，本研究对两亲本的原生质体制备和再生条件进行了优化，为后续的原生质体融合育种创造条件。1材料与方法1.1材料1.1.1实验菌种

酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）由本实验室保藏，文中简称酵母菌Y01；马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces

1%，pH值为5.4；②氯化钠高渗培养基：在YPD培养基中调pH值为6.0；③蔗糖高渗培养基：在YPD添加4%氯化钠，

培养基中添加15%蔗糖，调pH值为6.0；④甘露醇高渗培养基：在YPD培养基中添加15%甘露醇，调pH值为6.0。固体115℃灭菌30min。培养基成分同上，另加2%琼脂，1.1.3主要试剂

）PB溶液：pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。（1

（2）高渗缓冲液（PBS）：①蔗糖高渗缓冲液：PB溶液加入15%蔗糖；②甘露醇高渗缓冲液：PB溶液加入15%甘露醇；③NaCl高渗缓冲液：PB溶液加入4%NaCl。以上试剂均115℃灭菌30min。

（3）脱壁酶：蜗牛酶和纤维素酶，使用时按所需浓度用高渗缓冲液配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌（现配现用）。1.2方法1.2.1菌体培养

将酵母菌Y01和Y05分别转接一环入YPD液体培养基中，酵母菌Y01置30℃（Y05置37℃）、200r/min振荡培养24h。取上述培养物按0.3%的接种量接入新鲜的YPD液体培养基中，同上条件培养至一定时间，将细胞浓度调整为3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，用于制备原生质体。1.2.2原生质体的制备与再生

取上述培养的菌液5mL，4000r/min离心5min收集菌

marxianus）1911购自中国工业微生物菌种保藏中心，文中

简称酵母菌Y05。1.1.2培养基

①YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸出汁

收稿日期：2010-02-27

基金项目：国家“948”项目基金（2006-G37）；农业公益性行业科研专项（nyhyzx07-019）；福建省教育厅资助项目（JB09029）作者简介：包伟霞（1986-），女，硕士研究生，主要从事微生物发酵研究工作；许旭萍*，教授，通讯作者。

研究报告

中国酿造

2010年第9期总第222期·43·

体，菌体用PB缓冲液洗涤2次，无菌加入酶液，置30℃水浴100r/min振荡处理，每隔20min取样制片镜检，待视野中，

中有90%以上的细胞脱壁成为原生质体时，2500r/min离心10min收集原生质体，用蔗糖高渗缓冲液洗涤3~5次，经高渗缓冲液适当稀释后，涂布于高渗再生培养基平板，酵母菌Y01置30℃（Y05置37℃）恒温培养2d~3d。

原生质体的形成率及再生率的计算采用平板计数法[4-5]。1.2.3原生质体制备与再生条件实验

菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响：按照1.2.1方法将酵母菌Y01分别培养至7h、9h、11h和13h后，将细胞浓度调整为3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，取5mL，4000r/min离心5min弃上清液，菌体用PB缓冲液洗涤2次，加入脱壁酶（1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解70min。酵母菌Y05分别培养至6h、8h、10h和12h后，同上步骤加入脱壁酶（1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解50min。酶液配制原生质体稀释和再生采用15%采用4%NaCl高渗缓冲液，

蔗糖高渗缓冲液。计算原生质体形成率与再生率，以确定用于制备原生质体的最佳菌龄。

稳渗剂对酵母菌原生质体形成与再生的影响：酵母（菌龄9h）和Y05（菌龄8h）采用脱壁酶（1.5%蜗牛菌Y01

酶+0.5%纤维素酶）在30℃进行酶解，酵母菌Y01酶解70min，酵母菌Y05酶解50min。计算原生质体形成率与再生率。分别用NaCl高渗缓冲液、甘露醇高渗缓冲液、蔗糖稀释原生体高渗缓冲液作为渗透压稳定剂配制酶解液、和配制再生培养基。

酶浓度对酵母菌原生质体形成与再生的影响：将酵母分别采用2.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶、菌Y01培养9h后，

1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶和1.0%蜗牛酶+1.0%纤维素酶于30℃酶解70min。将酵母菌Y05培养8h后，分别采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶、1.5%蜗牛酶、1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶和1.5%纤维素酶在30℃酶解50min，计算菌株的原生质体形成率和再生率。酶液用4%NaCl高渗缓冲液配制，原生质体稀释和再生采用15%蔗糖高渗缓冲液。

酶解时间对酵母菌原生质体形成与再生的影响：在最佳菌龄、最佳酶浓度、最佳稳渗剂条件下，酵母菌Y01分别酶解50min、70min、90min和110min，酵母菌Y05分别酶解30min、50min、70min和90min，计算菌株的原生质体形成率和再生率。2结果与分析

2.1菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响

菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形成和再生的影响，结果见图1。

由图1可以看出，菌龄 …… 此处隐藏：3697字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……