第03章 显微镜教学指导(2)

共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。

4.3.7 紫外光显微镜

使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（ultraviolet microscope）研究单个细胞的组成与变化情况。

4.3.8 干涉相衬显微镜

干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。

偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英Wollaston棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜(滑行器)，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置(检偏器)，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，使二者发生干涉。

干涉相衬显微镜的优点是能显示结构的三维立体投影影像，与相衬显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强，产生类似于浮雕的效果。它使细胞的内部结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，因此适合应用于显微操作技术。

4.3.9 近场扫描光学显微镜

近场显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于150nm，内孔直径为50nm的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为50nm（可见波长的1/10左右）的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光量。这种技术的理论分辨率极限约10nm。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且既可以用在空气中（与电子显微镜必须在真空条件下相比要优越），又可以用在水中（与一般的光学显微镜相比也有优越性）。

这种光学显微镜技术将对研究活体中的病毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。由于探测器对可见光是灵敏的，还可以对生物样品进行荧光分析。这种显微镜还能用来研究材料的表面性质。

4.4 显微镜的使用、维护、常见故障及排除

4.4.1 光学显微镜的使用

低倍光学显微镜的使用：

①对光：转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转物镜转换器，使10倍物镜头对准镜台孔；然后升高聚光镜，打开光圈，将反光镜的凹面对准光源，直至视野明亮为止。

②将要观察的切片放在载物台上，固定好，并将要观察的部位移至中央。

③调焦距：旋转粗调螺旋，升高载物台，至物镜距玻片约0.5cm时，再缓慢降低镜台，直到看清图像为止。

④调节两瞳孔间的距离：一边用双眼自目镜中观察，一边用双手握住两个目镜管，前后或左右移动，直到双眼看到一共同视野为止。

⑤为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，欲使左眼图像清晰，需旋转镜管长度调节环。 高倍光学显微镜的使用：

用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的结构移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋转物镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高聚光镜，将光线调节到最亮的程度；然后，稍微转动微调螺旋，即可观察到清晰的图像。

油镜的使用：

用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移至视野中央，在标本所要观察的部位滴一滴镜油，旋转物镜转换器，将油镜头对准镜台孔，使油镜头下端与镜油接触，然后，轻轻转动微调螺旋，即可看清物像。使用油镜时，应把聚光镜的光圈充分开大。 用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗剂，将镜头和玻片擦净。

4.4.2 光学显微镜的维护

①搬动显微镜时，应该用右手握镜臂,左手托镜座，平贴胸前，以防撞碰。切勿用一只手斜提，前后摇摆。

②每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部件有无缺损，发现问题，及时报告。使用时，要严格按操作程序，正确地缓慢移动有关机械部分。

③禁止拆卸显微镜的各个部件，更不允许与其它显微镜对换，以免安装不当影响观察效果。

④如镜头表面有灰尘，应该用擦镜纸擦，不允许用口吹、手指抹，或用其它纸、布擦。

⑤显微镜用完后，将4倍镜头对准镜台孔，升高镜台，降下聚光器，打开光圈，盖好防尘罩，放回原处。

4.4.3 光学显微镜的常见故障及排除

光学显微镜的常见故障粗调的自动下滑，即调焦后导轨处在某一位置上，由于镜臂、镜筒、载物台等自身重量作用，在没有外力作用的情况下镜筒徐徐滑下。对下滑较轻的情况，双手各握紧一粗调焦螺旋，左手握紧不动，右手握紧粗调焦螺旋沿顺时针转动，即可制止下滑。

4.4.4 电子显微镜的维护及常见故障排除

①电子显微镜的日常维护：注意保持干燥和真空，常开机，多使用。

②电子显微镜常见故障：灯丝损坏，通常3个月左右更换一次。在安装灯丝时，必须使灯丝尖端与栅极孔的中心严格对正。装好灯丝抽真空，加上高压并使灯丝饱和后将在屏上看到一小亮斑，调节电子枪平移，使亮斑达到最亮。

4.5 显微摄影术

显微摄影术（photomicrography）是利用显微照相装置，把显微镜视野中所观察到物件的细微结构真实地记录下来，以供进一步分析研究之用的一种技术。

数码显微摄影以电子存储设备为载体，通过电感藕合器(CCD芯片)将光信号转换成相应模拟量的电信号，这种电信号经模拟数字转换器(ADC芯片)进行模拟及数字信号转换后，再经数字压缩记录到内存卡或闪速存储卡等一些移动式存储器中，形成数字影像文件。数码摄影装置从根本上解决了传统显微摄影装置取景观察不便、图像传送难、效率低、速度慢等问题。现在的主流数码相机产品都提供USB接口，能兼容IBM微型硬盘，支持高容量的CF/SM卡，CCD像素能达到四五百万，不但拥有了很高的成像品质而且可以将数字影像文件随时调入计算机内进行图像处理，与附加的相关设备来完成照片的显现、存储、修改、打印和传输等工作。