第03章 显微镜教学指导

1． 基本要求

1.1了 解

(1) 了解显微镜技术的产生和发展现状

(2) 了解光学显微镜的常见故障及其排除方法

1.2 熟 悉

(1) 熟悉临床常用显微镜的临床应用

(2) 熟悉光学显微镜的维护、调试与使用方法

(3) 熟悉扫描隧道显微镜的基本原理及特点

(4) 熟悉电子显微镜的临床应用

1.3 掌 握

(1) 掌握光学显微镜的性能参数、基本原理和基本结构

(2) 掌握常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件

(3) 掌握电子显微镜的类型和组成

(4) 掌握透射和扫描电子显微镜的基本原理及特点。

2． 重点难点

2.1重 点

(1) 光学显微镜的光学参数、基本原理和基本结构

(2) 临床常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件

(3) 临床常用显微镜的性能、用途

(4) 光学显微镜的调试与使用方法

(5) 电子显微镜的类型和组成

(6) 透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜的基本原理及特点

2.2 难点

(1) 临床常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件

(2) 光学显微镜的性能参数

(3) 透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜的基本原理及特点 3． 讲授学时 建议10~12学时

4． 内容提要

4.1光学显微镜

4.1.1 光学显微镜的工作原理

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，供人们提取物质微细结构信息的光学仪器。显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（object lens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ocular lens）。而相对于物镜的成像条件及最后二次成像于观察者的明视距离等条件的满足是通过仪器的机械调焦系统来实现的。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。

4.1.2 光学显微镜的基本结构

光学显微镜的基本结构包括光学系统和机械系统两大部分。光学系统是显微镜的主体部分，有包括物镜、目镜、聚光镜及反光镜等组成的照明装置。机械系统是为了保证光学系统的成像而配置的，包括调焦系统、载物台和物镜转换器等运动夹持部件以及底座、镜臂、镜筒等支持部件。一些特殊类型或高级显微镜还有一些附加装置。

显微镜基本结构示意图

4.1.3 光学显微镜的性能参数

放大率:显微镜的放大率(amplification)或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成(放大的)像的大小相对于原物体大小的比值。

数值孔径：数值孔径(numerical aperture)又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径角的一半(β)正弦值的乘积，通常缩写为NA。

分辨率：显微镜的分辨率(distinguishability)又称为分辨本领(resolving power)，是指透镜能分辨两点之间的最小距离。

视野：视野(visual field)又称视场(field)，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。 景深与焦长：景深(depth of field)又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深”。景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称“焦长”。

镜像亮度和清晰度：镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。

工作距离：工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。

4.2 电子显微镜

4.2.1 电子显微镜的基本结构

电子显微镜主要由电子光学系统、真空系统、供电系统、机械系统和观察显示系统等几部分组成。电子光学系统主要由电子透镜和电子枪组成。

真空系统主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。

供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。 机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制工作台等。

观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组成。

4.2.2 电子显微镜的分类及其应用

透射电子显微镜：透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50～100nm）。在生物医学中主要用于观察组织和细胞内的亚显微结构、蛋白质、核酸等大分子的形态结构及病毒的形态结构等，另外，透射电镜还是区分细胞凋亡与细胞坏死最可靠的方法。细菌细胞结构，鞭毛结构，放线菌的孢子结

构及孢子表面装饰物立体形状等超微结构的观察，都需用透射电子显微镜。

透射电子显微镜的实体图

扫描电子显微镜：扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。其分辨率一般为3nm～10nm，放大率为5倍～300 000倍，加速电压为1kV～30kV，SEM的景深长、视野大、图像有立体感、样品制备简单、放大率范围广、能够观察较大样品的局部细微结构。扫描电镜可以观察到微观世界的立体形象, 它的图像是三维的逼真反映出样品表面结构的凹凸不平，如细菌的形态，鞭毛大小结构，放线菌的孢子表面装饰物等。在生物医学上，扫描电镜主要用来观察组织、细胞表面或断裂面的显微和亚显微结构及较大的颗粒性样品(3nm～10nm)的表面形态结构。

扫描隧道显微镜：扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加电压（2mV～2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电流获取显微图像，而不需要光源和透镜。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm，已达原子量级的分辨率。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术。普通电镜只能观察制作好的固体标本。利用扫描

隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列，特别适用于研究生物样品和在不同实验条件下对样品表面的评价。STM有两种工作方式，一种称为恒流扫描方式，即采用电子反馈线路控制隧道电流使其大小恒定，而用压电陶瓷管控制针尖的表面扫描路线保持间距不变，随着表面高低起伏而上下运动。另一种工作模式是恒高度工作，在对样品进行扫描过程中保持针尖的绝对高度不变；于是针尖与样品表面的局域距离将发生变化，隧道电流的大小也随着发生变化；通过计算机记录隧道电流的变化，并转换成图像信号显示出来，即得到了STM显微图像。

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