发酵工程应用实例

发酵工程应用实例

第九章 发酵工程应用实例

发酵过程：菌种 孢子制备 种子制备 发酵液处理

（1）了解青霉素的发酵工艺、

青霉菌：为β—内酰胺类抗生素，为抗革兰氏阳性的抗生素，由真菌生产的次级代谢产物，

生长无关型

1929年，英国弗莱明（fuleming）发现青霉素 抗生素分类

1、根据抗生素的生物来源分

放线菌：链霉菌、诺卡氏菌属、小单孢菌属；

真菌：青霉菌属、头孢菌属、担子菌； 细菌：多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌； 植物或动物：蒜 蒜素；动物脏器 鱼素。

2、按抗生素化学结构的分类

-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类，包含一个四元内酰胺环

氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇

大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素，含有一个大环内酯作配糖体，以苷键和1-3个

分子的糖相连 四环类：四环素、土霉素，以四并苯为母核，大都为放线菌生产。

多肽类：多粘菌素、杆菌肽，含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链

的环状多肽

作用：抑制细胞壁合成。合成路径为氨基酸、肽类衍生物 生产工艺

1、菌种：产黄青霉

生长发育分六个阶段：

Ⅰ—Ⅳ期：菌丝生长期，适宜做种子；

Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期，菌丝生长趋势减弱，大量产生青霉素； Ⅵ期：菌丝体自溶期。

I期 分生孢子发芽；

II期 菌丝繁殖；

III期 形成脂肪粒，积累贮藏物，适于作种子； IV期 脂肪粒减少，形成中、小空泡； V期 形成大空泡，脂肪粒消失；

VI期 细胞内看不到颗粒，个别细胞出现自溶。

2、培养基：

碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等；

氮源：玉米浆、麸皮粉、无机氮源； 前体：苯乙酸或苯乙酰胺；（一次﹤0.1％） 无机盐：S、P、Ga、Mg、K等。 铁离子有害， 控制在﹤30µg/mL。

3、发酵条件控制

补糖：残糖降至0.6％（PH上升）；

补氮：氨氮0.05％，补硫铵、氨水或尿素；

发酵工程应用实例

PH：6.4—6.6，加糖、加酸、加碱调节； 温度：前期，25-26℃；后期， 23℃； 通气比：1：0.8；

溶氧：﹥氧饱和溶解度的30％；

消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂

详细如下

温度控制：前期25-26°C，后期23 °C；

pH控制：一般为6.4-6.6，加酸加碱及加葡萄糖控制； 通气：一般为1：0.8VVM； 溶氧：﹥氧饱和溶解度的30％

搅拌：要求发酵液中溶解氧量不低于30%。

泡沫与消沫：少量多次加入消沫剂，在发酵前期不宜多用，玉米油、豆油或化学合成消沫剂。

加糖控制：根据残糖量与发酵过程中的pH来控制，也可根据排气中CO2与O2量来控制，残糖降至0.6％（PH上升）。

补氮：发酵液氨氮控制在0.01-0.05%，补硫铵、氨水或尿素；。 加前体：残余苯乙酰胺浓度控制在0.05-0.08%。

4、青霉素的分离纯化

1. 过滤：板框、真空转鼓；

2. 萃取：醋酸丁脂，2-3次；（具体步骤：将发酵滤液酸化至pH2，后加相当于

发酵滤液体积1/3的醋酸丁酯，混合后以碟片式离心机分离；然后以1.3-1.9%NaHCO3在pH6.8-7.1条件下将青霉素提取到缓冲液中，再调pH2，将青霉素从缓冲液转入到醋酸丁酯溶液中） 3. 脱色：活性碳，150-200g/10亿单位； 4. 结晶：浓缩结晶或直接结晶； 5. 洗涤 6. 干燥

流程工艺

了解谷氨酸发酵生产工艺、

常用菌：北京棒杆菌，钝齿棒杆菌

发酵工程应用实例

氨基酸：氨基，羧基，与氢直接连接在αC上

谷氨酸 （ -氨基戊二酸）

（1）淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解

调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％至pH1.5。

H2N- C- H

糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下中和。

H-C-H

中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0

H-C-H

脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8％，在70℃及酸性

O =C-OH

条件下搅拌后过滤。

OH

① 斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。

L- 型

我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。

生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。

斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32℃培养18-24h ② 一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32℃ 培养12h。

③ 二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃ 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109 /ml。 ①尿适应期：素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。

措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。

② 对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32℃ ③ 菌体生长停止期：谷氨酸合成。

措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37 ℃。 ④ 发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。

H-C=O

措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。发酵周期一般为30h。 （1）培养基

① 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃

② 氮源：铵盐、尿素、氨水

C/N＝100：15 21，实际高达100：28 原因： 1）用于调整pH。

2）分解产生的NH3从发酵液中逸出。 ③ 无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中 磷酸盐对发酵有显著影响。

不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。

过多：a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。 b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩 合生成缬氨酸的前体物—— －乙醛乳酸， 使缬氨酸在发酵液中蓄积。 ④生长因子：生物素。青霉素

作用 ：

生物素：乙酰-CoA羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。含量高时，细胞膜致密，阻碍Glu分泌，引起反馈抑制。

发酵工程应用实例

青霉素：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞

壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。 （2）pH的影响及其控制

作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发

酵转向谷氨酰胺发酵。pH控制在中性或微碱性。

方法：流加尿素和氨水

（3）温度的影响及其控制（4）溶解氧的控制

不足：发酵液pH值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。 过大：NADPH2通过呼吸链被氧化，影响 -酮戊二酸还原

氨基化，使 -酮戊二酸蓄积。 1. 菌体生长阶段：30 34℃ 2. 产酸阶段：34 36℃

谷氨酸的提取